[发明专利]一种多步连环选择的血清核酸适配子体外筛选方法

说明书

技术领域

本项发明属生物医学检测分析技术领域，具体涉及一种将多步连环选择应用于核酸适配子筛选和鉴定过程中的高效率血清核酸适配子体外筛选新技术。

背景技术

核酸适配子是一种生物分子的人工单链核酸配体，通过SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。

核酸适配子筛选所用文库为人工构建，其中的单链寡核苷酸片段的两端为固定序列，中间为随机序列。固定序列为PCR引物提供结合部位，便于SELEX筛选过程中进行PCR扩增，制备下一轮筛选的文库。随机序列使文库中核酸序列的多样性极为丰富，当随机区长度为25个核苷酸，文库中核酸多样性理论上能达到10¹⁵（4²⁵=1.126¹⁵）。单链寡核苷酸的一个独特表现是容易形成各种形状的二级结构和三级结构，如发夹、口袋、假结、凸环、G-四聚体（G-quartet）等，它们通过分子构象上的“锁钥”关系与靶分子适配，加上氢键、范德华力的作用，与靶分子形成稳定的复合物。多样性达10¹⁵的巨大库容所拥有的丰富的寡核苷酸分子构象，可为自然界几乎所有种类的分子找到匹配的核酸适配子。

核酸适配子的功能与抗体类似，但与抗体相比具有许多优点：①高特异性和高亲和性：能够分辨出靶分子结构上细微的差别，亲和力甚至强于天然配体；②靶标广泛：从有机小分子、生物大分子到病毒颗粒、完整细胞等均可作为筛选靶标；③稳定性好：可长期保存，通过人工合成制备而无批间差异，可在常温下运输；④改建和修饰容易：可在核酸适配子的特定部位进行精确的标记、修饰或核苷酸替换；⑤应用优势：无免疫原性，可在体内反复使用；分子小，方便于体内影像诊断和治疗。目前核酸适配子的筛选与应用研究已涉及医学的各个领域，包括基础研究、临床诊断、疾病治疗和药物研发等。

SELEX技术是一种组合化学新技术，它利用化学合成的大容量单链随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，从中筛选出能与靶分子特异结合的寡核苷酸，并借助PCR扩增技术，使之指数富集，最终获得高亲和力、高特异性的核酸适配子。SELEX技术自1990年问世以来受到了广泛关注，从技术本身到研究应用领域都得到了迅速发展。除了经典的SELEX筛选外，在结合其它方法的基础上衍生出多种SELEX筛选方法，例如以荧光磁珠为介质衍生的荧光磁珠SELEX技术，以毛细管电泳为分离手段的毛细管电泳SELEX技术。此外，为适应某些特殊需求产生了切换SELEX、表达盒SELEX、基因组SELEX、消减SELEX、仿进化SELEX等。

用于SELEX筛选的靶标远比抗体制备的靶标丰富，包括无机分子、生物小分子、生物大分子、病原微生物、真核细胞等。目前，通过SELEX技术已筛选出各种不同类型靶分子的核酸适配子，包括与基因调控有关的核酸结合蛋白（如噬菌体T4 DNA 聚合酶、HIV-1 Rev蛋白、核糖体蛋白S1），非核酸结合蛋白（如凝血酶、各种细胞因子、辅因子、缓激肽、IgE抗体），小分子有机物（如ATP、茶碱、氨基酸、维生素），甚至金属离子、多糖、有机染料，以及完整的细胞、病毒、孢子等。

然而，尽管核酸适配子的筛选技术不断发展，筛选用的靶标也不断多样化，但以血清为靶标筛选核酸适配子至今尚未见报道。其原因可能是血清成分过于复杂，其中正常组分（如白蛋白）占绝大部分，而与疾病相关的特异性物质（如肿瘤标志物）丰度很低，因此以血清为靶标进行核酸适配子筛选理论上难以获得理想的筛选效果，筛选出的核酸适配子也难以鉴定，故是一个鲜有人探索的难题。然而，血清中含有已知和未知的各种疾病标志物，蕴藏着极为丰富的疾病发生、发展、诊断、治疗、预后相关的信息。由于取材容易、对患者的创伤小，血清也是目前最为常用且十分理想的临床标本。因此，建立可行、实用的以血清为靶标的核酸适配子筛选技术，有效筛选疾病标志物相关的特异性核酸适配子，建立基于核酸适配子的血清标本检测和分析技术，对于探索疾病的发生、发展规律和获取疾病的临床诊疗相关信息，都具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的：创建一种血清核酸适配子体外筛选技术，不受血清个体差异和非特异性组分的影响，能高效率、高通量筛选出疾病特异的血清核酸适配子群，为建立基于核酸适配子的血清特性系统性分析技术奠定基础。