[发明专利]一种将胞内蛋白基质表达的方法和其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种将胞内蛋白基质表达的方法和其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

根据定位方式，基因工程表达外源蛋白一般分为两种形式：胞内表达，目的蛋白在细胞质核糖体中合成后，在一系列伴侣因子帮助下仍定位于胞内；胞外表达，目的蛋白合成后借助蛋白本身的功能序列和宿主菌的加工运输体系分泌至胞外。胞外分泌型表达可大大简化下游纯化过程，节约成本，因此在大规模工业化生产中具有绝对优势。

大肠杆菌(Escherichia coli)遗传背景清楚，培养周期短，操作简单，是目前应用最广泛、最成功的外源重组蛋白表达系统。大肠杆菌天然存在5种分泌途径，各种分泌途径均有其特定的转运蛋白和分泌机制，且对重组蛋白均有独特的要求，一般来讲，只有在天然状态下为胞外酶在重组表达时才有可能实现基质分泌型表达，而未见胞内蛋白通过宿主菌的分泌系统转运至细胞外的报道。

大肠杆菌的细胞膜有两层，内膜由磷脂和膜蛋白组成，其中磷脂包括70-80％的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl-ethanolamine)，15-20％的磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol)和低于5％的心磷脂(cardiolipin)，外膜内侧富含饱和脂肪酸和磷脂酰乙醇胺，外侧主要为脂多糖。人为地增大细胞膜的通透性，可以加快胞内产物的排出速率，以利于目标蛋白在培养基中的积累。对细胞膜通透性进行调控的方法很多，从遗传学的角度来看，可以选育出细胞膜通透性突变株；从后期调控角度看，根据物质跨膜转运机制的不同，可以采取相应的方法。目前应用较为广泛的是化学法，在培养基中添加诸如青霉素、Mn²⁺、表面活性剂、Na⁺、甘露醇等，可在一定程度上破坏细胞膜的完整性，提高发酵产量。

角质酶是一种多功能酶，可水解各种可溶性酯类、乳化的甘油三酯、不溶性脂肪酸酯、不溶性多聚体角质等，目前已有报道来源于F.solani的角质酶具有磷脂酰乙醇胺(大肠杆菌内膜磷脂的主要成分，外膜的组成部分)的水解活性。因此可通过角质酶对大肠杆菌细胞膜磷脂成分的水解作用提高细胞膜的通透性来使胞内目标蛋白基质表达。

本发明选取两种重要的工业用酶β-半乳糖苷酶和异淀粉酶作为报告蛋白。β-半乳糖苷酶是一种多功能酶，能作用于乳糖的β(1→4)糖苷键，形成半乳糖基-酶复合物，在该酶的水解活性下，复合物进一步水解，生成半乳糖；而在该酶的转苷活力作用下，复合物进一步与单糖、二糖或三糖等结合，生成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶是工业酶法生产新型功能性低聚糖低聚半乳糖的主要用酶，市场需求大；异淀粉酶能够专一性地切开支链淀粉分支点中的α-1，6糖苷键，剪下整个侧枝，生成长短不一的直链淀粉。目前已广泛应用于淀粉糖浆、啤酒和酒精生产等多个淀粉深加工领域和医药领域。

发明内容

本发明提供了一种将胞内蛋白基质表达的方法，是将T.fusca角质酶基因(NCBI编号：AAZ54921)和胞内目标蛋白基因在宿主菌大肠杆菌中共表达，经发酵培养，收集发酵上清液。

为解决上述技术问题，具体方法为：

1)将pETDuet-1质粒和Tfu_0883/pET20b(+)进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，得到重组质粒Tfu_0883/pETDuet-1；

2)将Tfu_0883/pETDuet-1和含有胞内目标蛋白基因的重组质粒pET20b(+)进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，得到含有目标蛋白基因的重组质粒Tfu_0883/pETDuet-1；

3)将含有目标蛋白基因的重组质粒Tfu_0883/pETDuet-1导入宿主大肠杆菌；

4)步骤3)构建的重组大肠杆菌发酵生产目标蛋白，收集发酵上清液。

所述宿主菌可以为：E.coli BL21(DE3)、E.coliW3110、E.coliJM109、E.coliJM109(DE3)、E.coliDH5α等，其中优选E.coli BL21(DE3)。

所述携带角质酶和目标蛋白的载体为pETDuet-1、pCOLADuet-1等双启动子载体；pUC系列，pET系列，pT7-7，pGEX等任一一种。