[发明专利]用于传毒分子机制研究的无毒褐色桔蚜饲养方法

说明书

技术领域

本发明属于昆虫饲养领域，具体的说，涉及一种用于传毒分子机制研究的无毒褐色桔蚜的饲养方法。

背景技术

褐色桔蚜(Toxoptera citricida，Kirkaldy)，又称东方桔蚜，属于同翅目蚜总科Aphidoidea，是一种世界性分布的柑桔害虫，桔蚜不仅通过直接取食为害柑桔，而且是柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)的有效传播介体。柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)属于长线形病毒属(Closterovirus)，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒。柑桔衰退病毒引起的柑桔衰退病是一种具有经济重要性的病害，广泛分布于世界各柑桔产区，对全世界的柑桔产业造成了严重的威胁。

蚜虫人工饲料研究始于20世纪30年代，蚜虫人工饲料饲养技术的出现，使得蚜虫在脱离寄主植物后得以短期或长期存活。蚜虫人工饲料可应用于蚜虫传播病毒机制、营养生理、共生菌、毒理与杀虫活性物质生物测定以及昆虫与植物相互关系等方面的研究，已发展为这些研究的重要试验手段。

植物病毒介体传播分子机制的研究，主要集中在病毒参与传播的基因及其产物的确定。目前在昆虫传播病毒分子机制的研究中经常使用的方法之一是：人工饲养昆虫，使昆虫在脱离寄植物后能够正常存活，在饲养液中添加病毒编码的蛋白质、特异性蛋白抗体或在饲养液中添加病毒提取液、双链RNA，通过比较传毒率的变化，探讨昆虫传播病毒的相关因子，对于一些基因组较小的病毒，使用侵染性克隆缺失突变体进行传毒分子机制的研究，但CTV基因组比较大，构建侵染性克隆缺失突变体比较困难，因此，研究传毒分子机制时需要蚜虫在脱离寄主植物后得以短期存活，为研究传毒分子机制，需要寻找适合褐色桔蚜取食和生存的实用饲料。酵母提取液作为实用饲料的成分之一，一方面可以提供营养，另一方面液体黄色对蚜虫有引诱作用，有利于蚜虫取食。糖类是生物体内能量的主要来源，对蚜虫具有刺激取食和营养双重作用，不同的蚜虫所需的蔗糖浓度是不同，目前已对桃蚜和豌豆蚜等不少蚜虫种类已实现了人工继代饲养，有桔二叉蚜在人工饲养上饲养1代的报道，但尚无褐色桔蚜人工饲养的资料的报道，而且柑桔衰退病毒的蚜虫传播分子机理进展不大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无毒褐色桔蚜人工饲养的方法，使蚜虫在脱离寄主植物后得以短期存活且不影响传毒效率，以便于无毒褐色桔蚜传毒分子机制的研究。

本发明具体按如下步骤进行：

(1)利用无毒柑桔苗进行继代饲养得到无毒褐色桔蚜：从田间采桔蚜虫源，以初孵若蚜建立无毒种群，初孵若蚜是指刚出生尚未接触叶面的蚜虫，用脱毒柑桔苗或实生苗在养虫室内饲养褐色桔蚜，养虫室中设置温度为25±2℃，光照：黑暗为14∶10h，为了确保连续有新稍可用于饲养蚜虫，每两周修剪20株无毒柑桔苗，追施质量分数为0.5％尿素或复合肥促发新稍，若蚜会形成一个群体，群体太多就会产生有翅蚜虫。为了抑制有翅成蚜的形成和获得状态一致的无翅成虫，用毛笔轻轻将30头以上无翅成虫放在无毒柑桔苗新稍上产下一代若蚜，1～2天后将成虫转移到另一无毒苗上，下一代的1～2日龄的无翅成虫备用。不断挑用毛笔轻挑无翅成蚜于嫩梢，继代饲养得到无毒蚜虫备用；

(2)饲养液的配制与灭菌；饲养液为A或B两种，饲养液A为去离子水配制，其配制成分为：NaCl 7～10g/L，KCl 0.05～0.2g g/L，Na₂HPO₄·12H₂O2.9～5g/L，KH₂PO₄ 0.05～0.2g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖0～600g/L，pH调节为7.0～8.0，饲养液A在0.1MPa，121℃下高温灭菌20分钟，可在饲养液A中添加用于研究传毒分子机制的特异性蛋白或者特异性抗体；

上述饲养液B为去离子水配制，其配制成分为：Tris 1.2～2g/L，EDTA0.2～0.37g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖0～600g/L，pH调节为7.0～8.0，饲养液B在0.1MPa，121℃下高温灭菌20分钟，可在饲养液B中添加用于研究传毒分子机制的病毒提取液或者双链RNA；