[发明专利]应用昆虫细胞表达重组的中国鲎C因子

权利要求书

1.中国鲎C因子在昆虫细胞中的表达方法，其特征在于：

1)含中国鲎C因子基因的重组杆状病毒供体质粒pFASTBacHTA-FC转化含杆状病毒基因组的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac；

2)含有C因子基因的重组杆粒(FC-Bacmid)的筛选和鉴定；

3)含有C因子基因的重组杆粒DNA的抽提；

4)含有C因子基因的重组杆粒转染昆虫细胞；

5)检测C因子在昆虫细胞中的表达，确定最佳表达时间和感染复数。

2.按权利要求1所述的中国鲎C因子在昆虫细胞中的表达方法，其特征是：

a)所述含有C因子基因的重组表达质粒pFASTBacHTA-FC转化DH10Bac的方法，其特征是：取2μl浓度为0.1μg/μl的pFASTBacHTA-FC质粒转化100μl大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，冰上放30min，42℃热激90s，迅速放冰上5min，加入1ml LB，37℃复苏3.5hr后涂三抗性LB平板(50μg/ml Kanamycin，7μg/ml Gentamicin和10μg/ml Tetracycline)，37℃培养40hr后观测菌落的颜色；

b)所述含有C因子基因的重组杆粒的筛选和鉴定方法，其特征是：挑如a)中所述的白色单菌落，重新划平板培养，连续划两至三次，直到不产生蓝色菌落为止，挑连续划几次后仍然是白色的菌落到含有三抗性的LB试管中37℃培养4小时后，用PCR法鉴定阳性克隆；

PCR体系：F：100pmol，R：100pmol，dNTPs：各50pmol，5×Prime star DNA聚合酶buffer：10μl，Prime star DNA聚合酶：5U，无菌水补足50μl；

PCR反应条件：将上述PCR反应体系混匀，第一阶段95℃预变性3min；第二阶段95℃，1min；54℃，1min；72℃，3min20s；共进行30个循环；第三阶段72℃延伸10min；

引物为：

FC Primer F：5’-ATG GTC TTA GCG TCG TTT TT-3’

FC Primer R：5’-AAT GAA CTG CCT AAT CCA TG-3’

M13 Primer F：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

M13 Primer R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’

c)所述含有C因子基因的重组杆粒DNA的抽提，其特征是：挑经过PCR鉴定为阳性的单菌落至含有50μg/ml Kanamycin，7μg/ml Gentamicin和10μg/ml Tetracycline的5ml LB培养基的试管中，37℃培养 24小时；取1.5ml菌液离心去上清，用300μl溶液I(15mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM EDTA，100μg/ml RNase A)轻轻重悬菌体，再加入300μl溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)，轻柔旋转混匀，室温放置5min；慢慢加入300μl浓度为3M的乙酸钾(pH 5.5)，边加边轻轻混匀，然后置冰上10min；12000rpm离心10min，将800μl上清小心转移至已加入800μl异丙醇的EP管中，轻轻混匀，然后置冰上10min；12000rpm，室温离心15min；弃去上清，加入500μl 70％的乙醇，翻转几次以清洗沉淀，12000rpm，室温离心15min；重复一次；仔细弃去上清，让沉淀在空气中干燥10min，然后用40μl TE缓冲液溶解沉淀。此为重组了C因子的杆粒DNA，冻于-20℃备用。