[发明专利]快速检测咖啡因的胶体金检测试剂盒及其制备工艺

权利要求书

1.一种咖啡因胶体金检测试剂盒，包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗咖啡因-BSA单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测区喷点有咖啡因-载体复合物、质控区喷点有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。

2.如权利要求1所述咖啡因胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记的抗咖啡因-BSA单克隆抗体中，胶体金为粒径39-42nm的球形颗粒。

3.如权利要求1所述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)用两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金；

2)采用步骤1制得的胶体金标记抗咖啡因-BSA单克隆抗体获得免疫胶体金；

3)采用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂经预处理的玻璃纤维垫片，制得免疫胶体金纸片；

4)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷点咖啡因-载体复合物及羊抗鼠免疫球蛋白IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；

5)将滤样纸、步骤3制备的免疫胶体金纸片、步骤4制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条；最后将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒。

4.如权利要求3所述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤1)所述两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金具体包括下列步骤：

a)第一次还原氯金酸溶液：

制备浓度为0.0004-0.0005mol/L的HAuCl₄水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl₄与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶(8-9)，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，既制得14～16nm粒径的胶体金原溶液；

b)第二次还原氯金酸溶液：

将第一步制得的胶体金原溶液放置于4.0-4.5℃恒温冰浴中稳定温度，随后按胶体金原溶液与HAuCl₄水溶液体积比1∶(1.9-2.0)加入4.0-4.5℃的0.003-0.004mol/L HAuCl₄水溶液，随后立即边搅拌边滴加4.0-4.5℃的抗坏血酸与PVP(聚乙烯醇吡咯烷酮)的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl₄的摩尔比为(25-26)∶1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl₄的重量比为1∶(2.0-2.1)，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，既制得39-42nm粒径的胶体金溶液；

两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。

5.如权利要求4所述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0.01-0.02mol/L。

6.如权利要求4所述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合双蒸水水溶液中，抗坏血酸的浓度为0.017-0.019mol/L，PVP的浓度为0.137-0.139g/L。

7.如权利要求3所述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤3)免疫胶体金纸片的制备包括下列步骤：

I.用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金，获得OD₅₄₀值为1.0～2.0的免疫胶体金溶液；

II.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，干燥，制得免疫胶体金纸片。

8.如权利要求7所述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤I所述喷金缓冲液的组分为：8～12v％1.0M Tris液、0.2～0.4w/v％聚乙二醇20000、0.15～0.25w/v％牛血清白蛋白，0.1～0.3w/v％脱脂牛奶、0.25～0.35w/v％酪蛋白，和0.02～0.08w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.5±0.05，余量为水。

9.如权利要求7所述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤II所述预处理液的组分包括：0.5～0.8v％Tween-20，12～18w/v％蔗糖，溶剂为水。