[发明专利]一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高农作物胚胎出生率的培养方法，尤其是一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，属于植物培养技术领域。

背景技术

结球甘蓝(B rassica oleracea L. var. Capitata)是十字花科、芸薹属的植物，为甘蓝（Brassica oleracea L.）的变种。又名卷心菜、洋白菜、包菜等。结球甘蓝具有耐寒、抗病、适应性强、易储耐运、产量高、品质好等特点，在我国各地普遍栽培，在蔬菜栽培和供应中占有重要地位。对蔬菜的周年供应起很大的作用。并且大量的出口到国外，在蔬菜出口贸易中也占有相当重要地位。目前，我国结球甘蓝主栽品种大部分被日本、韩国等国外的公司所垄断，具有自主知识产权的品种较少，究其原因是因为我国结球甘蓝育种资源很少、开发利用不够，未配制出良好的品种。传统的育种方法主要是对市场上表现好的结球甘蓝品种进行多代自交分离，来获得其亲本，然后用于育种实践当中，然而，传统的多代自交分离的方法一般需要5-6年的时间才能选育到一个纯合的亲本材料，但其表现是否优良、能否与其它材料组配，以及配制出来的杂交种表现能否得到认可还需要3-4年的时间。近年来，针对传统方法出现的游离小孢子培养方法可以在1-2年内快速获得双单倍体纯系，比传统的方法缩短了3-4年的时间，从而大大缩短育种进程，同时，隐性性状也易于表达，丰富了育种资源。因此，结球甘蓝小孢子培养技术在优良自交系的创制和提高新品种选育的效率等方面具有重要作用。

在芸薹属作物中，自从Lichter（1982）首次报道油菜游离小孢子培养成功获得再生植株以来，很多国内外学者对此小孢子培养技术进行了大量深入的研究应用，并取得了一些成果。关于结球甘蓝游离小孢子培养最早见于Lichter（1989）和Takahata（1990）的报道，随后国内外学者在这一培养技术上开展了一系列的研究和改进，在提高结球甘蓝小孢子胚胎发生频率方面的研究也做了大量深入的研究，取得了一些成果。随后，严准等（1999，）、唐青林等（2000）、刘艳玲等（2006）、袁素霞（2009）等人也有报道，但结球甘蓝小孢子胚胎发生的效率普遍不高，对难出胚的品种来说，培养效果很不理想。有关芸薹属游离小孢子培养的大量研究表明，供体植株的基因型对小孢子胚胎发生的影响极为重要，它不仅影响产胚率，而且也影响胚的质量（Chuong et al.,1988），限制了小孢子培养技术在结球甘蓝遗传育种和基础研究中的进一步应用。虽然人们在提高结球甘蓝游离小孢子出胚率的影响因素方面做了一些研究工作，但是结球甘蓝游离小孢子出胚率仍旧不高，且在一些基因型中很难获得胚状体（方淑桂等，2005a，2005b；刘艳玲等，2006；陆瑞菊等，2006），严重妨碍了游离小孢子培养技术的实际应用，因此，寻找一种简便有效的提高结球甘蓝难出胚基因型品种出胚率的方法具有重要的实践意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，采用难出胚的结球甘蓝与易出胚的油菜花蕾按一定数目配比共培养，从而促进结球甘蓝小孢子出胚，提高小孢子培养的出胚率。

一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，包括以下步骤：

步骤一，取结球甘蓝和油菜花序上的花蕾进行混合，得到甘蓝和油菜的混合花蕾，进行灭菌处理； 

步骤二，在灭菌后的混合花蕾中加入B5洗涤培养基后研磨

成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀，在沉淀中加入35～45ml的NLN-13诱导培养基、8～12滴的活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；

步骤三，将小孢子混合悬浮液在黑暗条件下32～33 ℃热激处理1～3天后，移至黑暗、温度为 25±2 ℃的条件下培养20～30天，得到子叶型胚状体；

步骤四，将子叶期胚状体接种至胚状体固体分化培养基中，每天光照15±3小时、温度23±3℃下培养，直至分化，得到再生芽； 

步骤五，切取所述再生芽转接至生根培养基培养出苗后，按常规方法进行炼苗和移栽，得到再生植株；

步骤六，根据植株形态，按照田间观察的方法区分结球甘蓝和油菜的再生植株，即得结球甘蓝植株。