[发明专利]肺癌病变前期14-3-3thta水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与肺癌病理演变mRNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。    

背景技术

根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数260万，死亡人数近210万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。癌症诊治成本越来越高，按癌症患者的年治疗费用20万（贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20万），700多万患者，每年的花费是1.4万亿人民币，扣除成本35%约4千亿，每年约有1万亿人民币白白消耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症诊治模式一定要改变，本发明的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因水平癌症的治未病。

2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了一个年度报告，对1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞异质性（多态性）；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善（动物模型设计不科学）等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。

本发明人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊断。依照现有的临床医学影像（B超、CT、核磁共振成像等）及和其它生化（癌抗原、癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子、细胞流式技术）指标来诊断癌症，都是肿瘤形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断，这一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度来分析，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上（特殊病例除外），很难证实的是在这个病理演变过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶，可能癌细胞早已迁移到其它组织或器官生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同时，其它癌细胞通过不同途径迁移到其它部位克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在临床上以2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨（有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中），其实这时已经是晚期诊断和晚期治疗，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物（mRNA水平）上做更精确的早期筛查和诊断，在癌变前期或癌细胞形成（单克隆）前,就可以做到早期预测和筛查。

美国弗雷德·哈钦森癌症研究中心研究人员在一年时间里，检验了170名吸烟或曾经吸烟者的血液样本，其中85人被诊断患有癌症，85人没有患癌症。结果发现，患有癌症的测试对象中，51%的人血液中含有annexin1、14-3 -3θ和LAMR1三种蛋白质。研究中心教授哈奈什说：“这是关键的一步，这说明，实际上，某些抗原确实在诊断出肺癌前就开始活跃。这时，主体还没有任何症状。”14-3-3 theta基因与lamr1和annexin-1基因一样对肺癌的早期病理演变预警有非常重要的临床意义。研究同时证明14-3-3基因在肝癌的早期预警也有重要的临床意义。研究人员用TRIzol一步法提取肝癌组织、硬化肝组织及正常肝组织的总RNA并纯化mRNA.逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针与含有14-3-3基因家族成员的基因芯片杂交,用GenePix Pro3.0图像分析软件分析不同病变肝组织中该基因家族成员的表达差异,行半定量RT-PCR对结果进行验证并探讨差异表达基因的临床意义.结果:在肝癌组织中14-3-3基因家族成员呈差异表达,其中14-3-3γ在肝癌组织中明显下调,与肿瘤包膜的完整性相关，14-3-3η在肝癌组织中明显上调,与肿瘤患者的临床分期相关，14-3-3γ与14-3-3ηmRNA的表达强度呈负相关(r=-0.403,P＜0.05).结论:14-3-3基因家族调控机制的紊乱参与肝癌的发生、发展,其中14-3-3γ和14-3-3η与肝癌的关系最为密切。