[发明专利]一种同时快速检测多种核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物样品的检测与鉴别，更具体地说，涉及一种同时快速检测多种核酸的方法。

背景技术

随着现代分子生物学的迅速发展，新的核酸扩增技术不断出现。2000年Notomi等建立了一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，即环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的6个区域设计一对内引物、一对外引物共4种特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶在等温条件下进行反应，在1h内就能扩增出109个靶序列拷贝。LAMP反应的原理以及所使用到内、外引物如图1所示。4条引物中2条为内引物，2条为外引物。其中，内引物FIP(forward inner primer)包含F1c序列和F2(F2c区域的互补序列)，即5′-F1c-F2；内引物BIP(backward iner primer)包含B1c(B1区域的互补序列)和B2序列，即5′-B1c-B2。外引物为F3和B3序列。LAMP技术特异性强、灵敏度高、过程快速、操作及结果判定简单，广泛应用于临床诊断、食品卫生检疫及基因芯片的开发。

LAMP技术的结果判定方法常用的有三种：(1)琼脂糖电泳检测，若扩增条带呈明显梯状分布说明扩增成功；(2)焦磷酸镁作为LAMP的副产物是一种肉眼可见的白色沉淀，可以直接通过肉眼判断确定有没有扩增产物；(3)反应后在体系中加入SYBR GREEN I 1-2μL，如果体系中颜色呈橙色，说明扩增失败；如果颜色呈绿色，说明存在扩增产物。当样品中只含有一种待测核酸时，LAMP技术简单快速易用；但是，利用现有LAMP技术对样品中可能存在的几种核酸进行检测时，上述判定方法只能区分样品中是否含有待测的核酸，却无法区分含有几种，或具体哪几种，检测结果不够准确。

因此，迫切需要一种新的同时快速检测多种核酸的方法，该方法能够同时快速检测多种核酸，并且能根据检测结果区分待测样品中具有哪几种核酸。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时快速检测多种核酸的方法，旨在解决现有技术中同时检测多种核酸时，不能准确区分待测样品中含有哪几种核酸的问题。

为了实现本发明的目的，本发明是这样实现的，一种同时快速检测多种核酸的方法，包括以下步骤：

A.利用与多种靶标核酸分别对应的引物，在同一反应体系中，对待测样品同时进行多种靶标核酸的LAMP扩增，得扩增产物；与每种靶标核酸对应的引物中的至少一条带有标记物，各靶标核酸对应的引物所带的标记物不同；

B.对扩增产物所携带的标记物进行检测，并根据标记物的检测结果判定待测样品中所含有的靶标核酸的种类。

其中，所述步骤B之前还包括步骤：

B’.对LAMP扩增反应之后的产物进行纯化，得到带标记的扩增产物。

其中，所述步骤A之前还包括步骤：

A’.对待测样品进行处理，得到待测靶标核酸处理液。

进一步的，所述步骤A’中的对待测样品进行处理的方法采用冻融处理、通透处理和核酸提取中的至少一种。

其中，上述步骤A’中对样品进行处理，其目的是使待测多种核酸的序列能够暴露于后续的扩增体系中，能够让带有不同标记的引物结合其上顺利进行LAMP扩增。

其中，所述步骤A中的标记物，与引物结合的连接形式为R1-R-R2，其中R1为引物上携带的末端基团，R2为标记物上所携带的末端基团，R则为R1与R2之间形成的化学键或中间偶联剂。

其中，上述步骤A中的标记物，包括但不限于：放射性物质、抗原、半抗原、抗体、酶、生物素、寡核苷酸标签或荧光标记物。

其中，所述标记物为寡核苷酸标签，该寡核苷酸标签优选位于内引物中。所述内引物如图1中所示，以FIP为例，该内引物包含F1c序列和F2-(F2c区域的互补序列)两部分，即5′-F1c-F2，其互补靶标序列相对外引物F3的位于靶标序列内部，因此称为内引物。当寡核苷酸标签位于内引物时，只能位于内引物中F1c与F2两部分连接的中间位置。

进一步的，若上述标记物为寡核苷酸标签，则步骤B中所述检测方法采用荧光探针杂交法、基因测序法中的至少一种；

若上述标记物为荧光标记物，则步骤B中所述检测方法采用光谱分离法。上述光谱分离法是指利用不同荧光标记物的激发光谱与发射光谱不同的特点，采用多色分光仪进行光谱分离从而准确区分扩增物的方法。

其中，上述待测样品包括但不限于食源性致病菌、病毒或临床检测样品。