[发明专利]一种肠道病毒检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种一种肠道病毒检测试剂盒，尤其涉及一步法四重荧光定量RT-PCR在同一个反应管内同时检测患者粪便或者咽拭子标本中CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒核酸检测方法，可应用于CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒引起的暴发疫情的实验室应急诊断及临床诊断。

背景技术

柯萨奇病毒(Coxsackie virus,CV)是由Dalldoff和Sickles于1948年首次从纽约市柯萨奇镇的一名类脊髓灰质炎患者的粪便中分离得到。它属小RNA病毒科的肠道病毒属（enteroviruses），对乳鼠的敏感性很高，根据它们感染乳鼠产生的病灶不同，柯萨奇病毒可以分为A、B两组。其中A组有23型病毒，B组有6型病毒。

    1956年Javett首次报道病毒性心肌炎(viral myocardit,VMC)主要由柯萨奇病毒引起。心肌炎是一种心肌局灶性或弥漫性病变, 其特征为间质性炎性细胞浸润, 心肌坏死及变性。心肌炎与多种病毒及发病因素有关。病毒的直接作用和机体的免疫反应是病毒性心肌炎的主要发病机制，临床上以病毒性心肌炎最多见。临床上病毒性心肌炎最常见的发病方式为一般型，发病前l-2周常有肠道或呼吸道感染史，如腹泻、感冒等，然后出现乏力、面色苍白、精神不振、胸闷气短等症状，检查可发现心脏扩大，心律不齐或早搏等心脏异常体征。另外暴发型和隐匿型对患儿的威胁最大，必须引起重视。目前对病毒性心肌炎的临床诊断, 主要依靠临床症状及常规生化检查和心电图，血生化检查中最常用的指标是心肌酶谱和心肌肌钙蛋白。但是由于病毒性心肌炎发病初期的症状不典型，往往出现临床症状时已经累及心肌，引起心肌不可逆的损伤，造成严重后果。另外，医院内感染越来越受到重视，一巳发生院内感染的爆发，后果无疑是非常严重的。因此，早期、及时、准确的诊断病原刻不容缓。

传统的诊断病毒感染的方法主要是病毒分离和血清学方法。病毒分离操作复杂，耗费时间长，容易导致污染，不便于临床应用。在临床病原学诊断上，常规的血清学方法检测抗体仅是一个反映感染的间接指标，不能替代直接的病原学检测，无法明确诊断感染病毒的种类。

实时荧光定量PCR技术具有全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、可以实时定量，并且有效解决了扩增产物污染等优势，克服了以往临床传统诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床病原诊断提供了一种有效、快速的检测手段。随着技术的改进及方法的不断完善，此技术已越来越多地应用于临床各科室，为临床诊断提供了准确、及时、高效的实验室依据。但是单管实时荧光定量RT-PCR检测一种病原，不仅耗时耗力，也浪费试剂耗材，因而建立可同时检测多种病原的多重实时荧光定量RT-PCR诊断方法与诊断试剂尤其重要。本发明采用的单管一步法四重荧光定量RT-PCR，不仅能够同时检测CoxB1、CoxB2、CoxB3以及其他肠道病毒，同样具备较高的特异性和灵敏度。

发明内容

本发明的目的是提供一种肠道病毒检测试剂盒，是一种一步法四重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本试剂盒包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品（CoxB1、CoxB2、CoxB3、肠道病毒）、阳性对照品（CoxB1、CoxB2、CoxB3、肠道病毒）、阴性对照品，盒体设有容器孔，分别放置定量RT-PCR反应液管、酶混合液管、引物探针混合液管、标准品管（CoxB1、CoxB2、CoxB3、肠道病毒）、阳性对照品管（CoxB1、CoxB2、CoxB3、肠道病毒）、阴性对照品管。

其中定量RT-PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶等、引物探针混合液含四种病毒的特异性引物和相应的四种不同荧光标记的探针，且引物探针混合液管为棕色管，阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为CoxB1、CoxB2、CoxB3及肠道病毒的阳性质粒样品。

上述标准品包括CoxB1、CoxB2、CoxB3及肠道病毒标准品，其保守区基因序列如下：

本发明提供的荧光定量试剂盒需于-20℃储存，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件保存。

本发明的另一个目的是提供上述的一种肠道病毒检测试剂盒在检测CoxB1、CoxB2、CoxB3以及其他肠道病毒中的应用。