[发明专利]阻断HIV-1膜融合的小环型DNA重组载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于病毒学领域，具体涉及一种能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体，其包含编码HR212的核苷酸序列和小环DNA载体。本发明还涉及一组阻断HIV-1膜融合过程的小环型DNA基因治疗剂，其包含能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体，其有效成分是编码七肽重复三螺旋蛋白HR212的核苷酸。本发明还涉及编码七肽重复三螺旋蛋白HR212的小环型DNA重组载体在制备用于抗HIV-1的感染的基因治疗剂中的应用。

背景技术

HIV感染已经是全球性的公共安全问题，过去两次有代表性的疫苗临床试验的失利显示了HIV疫苗开发的难度、短期内疫苗上市期望的渺茫。因而开发新的HIV抑制剂也将是长期的任务。现有的HIV小分子抑制剂是控制HIV感染后患者疾病发展的主要手段，但是这些药物的副作用以及HIV病毒的高变异能力，是激发寻求现有药物基础以外的其它治疗药物的源动力。寻求非传统形式的预防HIV特定途径感染的药物，是目前发展的一个重要方向，特别是随着感染人数的增加，生活观念的改变，出现易感人群开始向普通大众转移的趋势。寻找更多其它类型的治疗性药物，仍有重要的意义。

1.HIV药物的耐药性以及膜融合抑制剂的优点：

目前，HIV治疗的主流药物是逆转录酶抑制剂与蛋白酶抑制剂，近年来Merck开发的整合酶抑制剂也是有效的小分子抑制剂，还有许多其它正在研究的HIV病毒释放、包装相关的抑制剂等。

但是，艾滋病病毒是一种突变率极高的病毒，美国疾病控制和预防中心，对美国10个城市700多例尚未治愈病人的抗逆转录病毒药耐药情况调查后发现，抗艾滋病病毒药耐药发生率因危险程度、种族、地区和检查时间差异而不同。因此，艾滋病病毒的流行并非单一不变，而是呈多样化、重叠式地方性流行。这些都将增加单一药物治疗艾滋病的困难，

由于艾滋病病毒的多变与顽固，临床上提倡多种药物配伍使用治疗。使用两种不同的核苷类逆转录酶抑制剂(如齐多夫定、拉米夫定、斯它夫定、扎西它宾、双脱氧肌苷等等)，加上一种(或两种)蛋白酶抑制剂(如英迪那菲、里托那菲等等)的鸡尾酒疗法是常用的策略。但是其仍不能解决小分子药物本身靶位点局限性，微小的突变就可能使药物失效，而产生新的耐药株。

目前，研究发现HIV病毒感染宿主细胞时，需要通过一个膜融合的过程。在该过程中，HIV病毒参与这一膜融合过程的囊膜上的gp41分子中有相对保守的两段区域，可作为构建病毒抑制剂的元件。

由于该类抑制剂具有广泛的抑制活性及高抗变异HIV株的特性，使得该类产品的潜在需求巨大，如防止母婴传播、机会感染等预防型用药，以及对于现有药物产生耐药性时的替代用药等，市场需要明确。

本发明中用到的HR212，是我们找到的一种有效的七肽重复三螺旋HIV抑制剂的组合方式(Ni，L.，G.F.Gao，et al.2005)。通过真假病毒实验，严格地按《抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则》(国食药监注[2006]639号)的要求检测的结果，可以确认它在纳摩尔浓度抑制HIV复制，其抗HIV活性与FDA批准上市的多肽融合抑制剂T-20相似；它同时也在纳摩尔浓度抑制T-20耐药株复制；而且该蛋白稳定性高，其药效时间比T-20要长10倍以上。对酸、蛋白酶、温度有较强的耐受力(Pang，W.，R.R.Wang，et al.2008)。因而外分泌表达该蛋白更具潜力。

2.小环型DNA制剂的优势

使用小环DNA作为基因治疗的载体，由于它去除了复制子、抗性基因以及其它一些易于产生免疫原性区和易于产生基因沉默的序列，有较高的安全性且易于表达。同时，小环DNA由于去除非必需基因后，序列长度变短，更有利于将基因转染进细胞。另外，小鼠体内实验证实，体内基因给药时，小环DNA作用存活的时间长达三周，比一般质粒多一周。这几个方面共同决定了小环DNA具有其它载体不可替代的优势。

3.本发明的重要特点

使用小环型载体表达特定基因，是一项容易获知的技术。但是使用已知的技术，将能表达HR212的基因克隆到小环载体上，表达HR212蛋白是可以实现的，但要将HR212蛋白分泌到细胞外，相当艰难。目前为止，还没有人能够实现将HR212蛋白分泌到真核细胞外的表达。