[发明专利]一种抗虫蛋白Cry1A.301、其表达载体及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和生物防治领域，具体地说，涉及一种抗虫蛋白Cry1A.301、其表达载体及应用。 

背景技术

Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringHansis)。它在芽孢形成过程中产生δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白，这些蛋白具有很高的杀虫活性。一般认为，晶体蛋白的杀虫作用分为5个步骤：包括溶解、酶解活化、与受体结合、插入、孔洞或离子通道形成，每个步骤都能够影响晶体蛋白的杀虫效果(Moonsom等，2007)。伴胞晶体进入昆虫机体后，在中肠的碱性条件下二硫键被打开，溶解为前毒素，然后在胰蛋白酶的作用下激活成有活性的毒素蛋白。然后毒素蛋白与中肠上皮细胞膜受体结合，有毒性的α-螺旋穿透细胞质膜形成孔或灶，破坏细胞膜表面的膜电势，细胞渗透性平衡失调，胀破裂解，中肠坏死，围食膜和中肠上皮受损，中肠内的碱性物质进入血腔，导致昆虫麻痹死亡(Soberón等，2009)。在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种它们编码的杀虫晶体蛋白。 

1986年，首批转基因植物(抗虫、抗除草剂)被批准进入田间试验。1987年，比利时Vaeck等人首次获得转Bt杀虫蛋白的抗虫烟草，但只能检测到微弱的抗虫性，其表达蛋白几乎检测不到，只占可溶性蛋白的0.001％。同年又有两次获得Bt转基因植株的报道(Barton等，1987；Fischhoff等，1987)。1989年哺乳动物抗体重链和轻链基因在烟草中成功表达并正确组装成有功能的抗体。到1990年，至少有7个研究小组获得Bt转基因植物并应用于大田试验(Estruch J等，1996)。 1993年，Michael等人对Cry1Ab基因进行改造，获得Bt转基因植株，对玉米螟有很好的抗性。KozHal(1993)等人工合成了一个G+C含量达到65％的结构基因(与野生型CryIA(b)基因的同源性为65％)，利用基因枪技术把该合成基因导入玉米品种，培育出了抗虫转基因玉米，转基因植株能高水平表达Cry1A(b)抗虫基因。1996年，Joachim W等人将Cry1Ab进行截短修饰，转化水稻，获得转Bt水稻，靶标害虫死亡率达100％。1998年，Cheng等人根据植物所偏爱的密码子，改造了Cry1Ab和Cry1Ac基因用农杆菌转化法转化水稻获得转基因植株，R2代虫试，5天内有100％致死率。Bohotova等(2001)人工改造合成Cry1B基因，转化热带玉米得到转基因玉米能有效防治玉米螟。