[发明专利]中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。 

背景技术

鲎是一种极其珍贵的海洋无脊椎动物，也是海洋动物界现存的“活化石”，其经济价值和科研价值很高。鲎缺乏获得性免疫系统，在抵抗病原侵袭的过程中形成了多种天然防御系统，在这些防御系统中，鲎素(tachyplesin)发挥了主要的抗病原作用。鲎素是一类存在于鲎血细胞中的具有抗菌活性的阳离子多肽，它的发现被医学界称为“抗生素”研究的一个里程碑，是后抗生素时代到来的标致。自1988年日本学者Nakamura T从东方鲎中分离提取鲎素以来，鲎素的研究引起了人们的广泛关注，现己知道，鲎素是一种2.3Ku的阳离子抗菌肽，由17个氨基酸组成，形成2个二硫键，其羧基端带有1个α精氨酰胺，1988年这种肽被命名为Tachyplesin I。研究表明，鲎素具有以下抗菌特性：(1)杀菌活力高，致死浓度均在μmol/L级；(2)作用迅速，往往在几秒或几分钟内可将99％以上的病原杀灭；(3)对真核生物细胞无毒性；(4)活性稳定，比较耐热，100℃处理30min不丧失其抗菌活性；(5)在高盐环境下同样具有抗菌活性，这是海洋抗菌肽的一个重要特征。鲎素的抗微生物作用己远远超过目前抗生素药物的作用范畴，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌及囊膜病毒均能产生有效的杀伤作用，且没有耐药性问题，因此应用前景十分诱人。 

发明内容

本发明的目的是提供一种中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株。 

本发明菌株为中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC No.5462。 

本发明菌剂，其活性成分为中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，CGMCC No.5462。 

本发明中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株在饲料添加剂中的应用。 

本发明作为饲料添加剂的优势在于：一是高效绿色，表达的抗菌肽可具有广谱的抗细菌、抗病毒、抗霉菌等广泛的生物学效应，且不产生耐药性，无残留；二是补充蛋白，酵母菌本身是高蛋白的饲料添加剂和胃肠道正常菌群的一部分，可以同时起调节胃肠菌群和补充营养的作用。用它表达的药用蛋白不需进行大量的宿主安全性实验，外源蛋白的分泌型表达使其纯化更加简便。三是兼顾抗生素，酵母菌由于对抗生素和抗菌药具有抗性，解决了目 前微生态制剂不能同时应用抗生素的弊端。而且，己报道阳离子抗菌肽与传统抗生素联合用药时会产生协同作用。因此，基因工程抗菌肽酵母制剂是一种适合在畜牧业推广应用的、有益于肉类产品质量和安全的新型饲料添加剂，具有广阔的应用开发前景。 

本发明应用的两个关键点在于：一是抗菌肽的高效表达。抗菌肽是动物的体内成分之一，是一类小分子短肽，具有安全、无残留、无毒副作用的良好特性，是理想的安全抗菌制剂，无任何毒副作用，对多种病毒和细菌性疾病均有显著的预防效果，同时具有改善畜禽生产生长性能、减少机体发病的作用，能有效替代饲用抗生素或化学合成药物的使用，具有良好的推广应用前景。二是酵母菌体蛋白。发酵产物富含生物活性蛋白、优质的维生素及促生长因子，可显著提高机体免疫力和健康水平。具有天然酸、甜、酒曲、酵母芳香味，诱食效果佳，可显著提高畜禽出栏重。 

附图说明

图1是温度和糖浓度对表达上清影响的三维响应面图； 

图2是温度和pH值对表达上清影响的三维响应面图； 

图3是糖浓度和pH值对表达上清影响的三维响应面图； 

图4是自控罐发酵操作各因素曲线图； 

图5是摇瓶和发酵罐发酵产物Tricine-Glycerol-SDS-PAGE结果比较； 

图6是薄层扫描比较分析结果； 

图7是表达上清冻干粉Tricine-SDS-PAGE鉴定； 

图8是表达上清冻干粉； 

图9是表达上清的质谱分析结果； 

图10是鲎素高效液相色谱标准曲线； 

图11是高效液相色谱分析TP I表达上清。 

具体实施方式

本发明菌株为中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC No.5462。 

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 

保藏日期：2011年11月16日 

保藏编号：CGMCC No.5462 

分类命名：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。