[发明专利]提取堆肥宏基因组DNA的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取堆肥宏基因组DNA的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用。

背景技术

堆肥本身含有较多的抑制因子，且堆肥过程中产生大量腐植酸，这些物质会对总DNA(宏基因组DNA)的提取产生强烈的影响，很难提取到可以作为PCR扩增模板的总DNA。

反硝化细菌(denitrifying bacteria)，是硝化和反硝化研究中非常重要的一种细菌。传统的反硝化细菌筛选方法是使用培养基进行培养接种，单培养周期就要14天，整个筛选过程一般需要两周以上，耗时太长，且准确性很差。而且环境中的微生物99％是不可培养的，传统的筛选方法大大限制了人们对土壤微生物资源及其基因资源的研究与利用。

对反硝化细菌的研究可有助于堆肥过程中反硝化菌的衍替情况进行研究，进一步了解堆肥过程中硝化和反硝化的过程，有助于更深入地了解堆肥发生的机理，从而更好地实现对其技术的控制和优化。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取堆肥宏基因组DNA的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用。

本发明提供的提取堆肥宏基因组DNA的方法，包括如下步骤：

(1)将堆肥样品和DNA提取液置于离心管中进行物理裂解；所述物理裂解包括2-4次如下步骤：液氮处理10-20min(如10-15min或15-20min)，然后63-67℃(如63-65℃或65-67℃)水浴融化；

(2)在完成步骤(1)的离心管中加入溶菌酶，36-38℃(如36-37℃或37-38℃)水浴25-35min(如25-30min或30-35min)；

(3)在完成步骤(2)的离心管中加入蛋白酶K，36-38℃(如36-37℃或37-38℃)水浴25-35min(如25-30min或30-35min)；

(4)在完成步骤(3)的离心管中加入18-22g/100ml(如18-20g/100ml或20-22g/100ml)的SDS水溶液，63-67℃(如63-65℃或65-67℃)水浴100-140min(如100-120min或120-140min)；

(5)将完成步骤(4)的离心管18-22℃(如18-20℃或20-22℃)、12000-14000g(如12000-13000g或13000-14000g)离心13-17min(如13-15min或15-17min)，收集上清液；

(6)在完成步骤(5)的离心管中加入DNA提取液和18-22g/100ml(如18-20g/100ml或20-22g/100ml)的SDS水溶液，63-67℃(如63-65℃或65-67℃)水浴8-12min(如8-10min或10-12min)，然后18-22℃(如18-20℃或20-22℃)、12000-14000g(如12000-13000g或13000-14000g)离心13-17min(如13-15min或15-17min)，收集上清液；

(7)将步骤(5)的上清液和步骤(6)的上清液合并；

(8)将步骤(7)的上清液和酚-氯仿-异戊醇混合液等体积混合，混匀后18-22℃(如18-20℃或20-22℃)、12000-14000g(如12000-13000g或13000-14000g)离心8-12min(如8-10min或10-12min)，收集上清液；所述酚-氯仿-异戊醇混合液是将25体积份苯酚、24体积份氯仿和1体积份异戊醇混合得到的；

(9)将步骤(8)的上清液和异丙醇混匀，18-22℃(如18-20℃或20-22℃)沉淀50-70min(如50-60min或60-70min)，收集沉淀，即为堆肥宏基因组DNA；步骤(8)的上清液和异丙醇的体积比为1∶0.5-0.7(1∶0.5-0.6或1∶0.6-0.7)。

所述步骤(1)中，所述物理裂解可包括3次如下步骤：液氮处理15min，然后65℃水浴融化。

所述步骤(2)中，所述36-38℃水浴25-35min具体可为37℃水浴30min。

所述步骤(3)中，所述36-38℃水浴25-35min具体可为37℃水浴30min。

所述步骤(4)中，所述SDS水溶液的浓度具体可为20g/100ml，所述63-67℃水浴100-140min具体可为65℃水浴120min。

所述步骤(5)中，所述18-22℃、12000-14000g离心13-17min具体可为20℃、13000g离心15min。