[发明专利]携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱的获得方法及其应用

说明书

技术领域

本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱的获得方法及其应用。

背景技术

水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus, RRSV)是上个世纪70年代末发现的一种新病毒，在东南亚、东亚和南亚一些国家局部发生，对水稻生产造成一定影响。目前主要发生流行于我国的广西、福建、湖南、江西、贵州、云南等地。病株表现浓绿矮缩，叶片扭曲呈锯齿状缺刻，在叶背和叶鞘生有细长脉肿。分蘖期前发病不能抽穗，后期发病，抽穗不完全、谷粒不充实等症状。发病田块一般减产10％～20%，严重的减产可达80％～100%，是影响水稻产量比较严重的病毒病害之一。RRSV为呼肠孤病毒科水稻病毒属(Oryzavirus)的典型成员，引起水稻齿叶矮缩病。RRSV基因组包括10条双链RNA片段(S1-S10)，其形态结构和基因组双链RNA的电泳图谱与该科另外两个属—植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)和斐济病毒属(Fifivirus)的病毒有较大的区别。RRSV具有双层衣壳，呈二十面体结构，完整病毒粒体的直径约为65nm，核心颗粒约50nm。电镜下可观察到直径50～66nm或是40nm的病毒粒子分布在感病水稻叶片韧皮细胞的病毒质体(viro-plasm)中；带毒虫体内的器官或组织里也可观察到直径40～45nm或50～75nm两类球形结晶状粒子，聚集或是分散地排列在细胞质的病毒质体中。水稻锯齿叶矮缩病毒主要由介体昆虫褐飞虱传播，病株液汁、种子和土壤均不传毒。其自然寄主有水稻、蟋蟀草、水蜈蚣和稗草，人工侵染的植物有大麦、小麦、燕麦、玉米、甘蔗、稗等10多种。RRSV的介体昆虫褐飞虱(Nilaparvatalugens)是一种迁飞性昆虫，其传播为持久性方式，但不经卵传播。褐飞虱的若虫蜕皮但不失毒，病毒在虫体中的分布以唾液腺中含量最高。介体最小获毒时间是3小时（h），平均9天(d)。最短的传毒期是1h，接种后10-36d显示症状，传毒率大约为40％。幼虫可能比成虫的传毒效率更高，雌虫和雄虫，长翅型和短翅型传毒效率相同。介体传毒通常具有间歇性传毒期，可保持1-4周或终生传毒。不同地理种群的褐飞虱具有相似的传毒特性。

目前RRSV在我国多个省份流行，已严重影响我国的水稻粮食生产，而抗病品种应用是水稻病毒病最经济、最有效的方法，这就决定迫切需要建立一种RRSV水稻抗性品种的鉴定方法，为抗RRSV的水稻资源的发掘、抗性品种鉴定和品种选育提供技术手段。因为RRSV传播方式的特殊性，不能用病汁液摩擦接种方式进行接种且不经卵传播，本发明专利采用在病株或冻存病样上饲喂的方式获得携带RRSV的褐飞虱，这为水稻抗性品种的鉴定、抗病选育、抗RRSV的特异性单克隆抗体的筛选以及褐飞虱与RRSV的互作研究提供物质和技术支持。且本发明提供的通过饲喂方式使褐飞虱从冷冻叶片上获得RRSV的方法，解决了患病植株难以长期保存的问题，拓宽了研究的时间，有利于抗病品种的选育、抗RRSV的特异性单克隆抗体的筛选以及褐飞虱与RRSV的互作等研究工作。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱的获得方法及其应用。

携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱的获得方法的步骤如下：

1）褐飞虱的获得

从非水稻齿叶矮缩病毒发生地区的水稻田间捕获褐飞虱后，在室内用非抗虫水稻品种的无毒秧苗饲养，饲养温度为26～30℃，相对湿度为60 %～75 %，光周期为16L：8D；待褐飞虱成虫交配后单头虫单独产卵，随机抽取种群中10%的褐飞虱用RT-PCR和dot-ELISA方法分析带毒情况，保留不带毒雌虫的后代并建立室内种群，以后每代随机抽取种群中10%的褐飞虱用RT-PCR、dot-ELISA方法确定褐飞虱不带水稻齿叶矮缩病毒，即获得不携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱；

2）褐飞虱的获毒

褐飞虱从冷冻保存感病水稻病株中获毒

用滤纸保湿下1～2龄褐飞虱若虫饥饿2～3小时；-10～-80℃冰箱中取出冷冻保存的感染水稻齿叶矮缩病毒的水稻病株1～3株，放置温室或4℃冰箱中解冻1～3小时后移入以尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器或烧杯中，然后放入已饥饿2～3小时的20-300只1～2龄褐飞虱若虫，饲毒1～2天后将存活的褐飞虱移至养虫的健康水稻苗，饲毒褐飞虱在健康水稻苗上经过约10～15天病毒循回期后，用RT-PCR、dot-ELISA方法检测褐飞虱体内的水稻齿叶矮缩病毒，分析其带毒率，获得携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱；