[发明专利]一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白纯化技术，具体的说是一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法。

背景技术

木质纤维素是世界上最丰富、最廉价的可再生资源，包括甘蔗渣、秸秆、玉米芯等。降解为单糖，发酵生产燃料乙醇被看做是对其最有效的利用方式之一。降低燃料乙醇的生产成本成为其发展的核心部分。到目前为止，许多策略都已经开发出来，其中以纤维素酶等为中心，旨在研发高效地木质纤维素糖化催化剂无疑是最有效的策略之一。

随着技术的进步，越来越多参与木质纤维素降解的基因及相对应的水解酶，被分离和纯化出来。其中来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的多糖水解酶系复杂而完整，能够高效地降解木质纤维素为单糖。分离、纯化其中的各种组分，是研究其酶学性质，研发高效酶制剂的基础和前提。遗憾的是，关于这些酶组份的分离纯化，大都需要复杂的层析步骤或者只能分离其中的一类组份，如纤维素酶、β-木糖苷酶等，这不能满足协同性等，尤其是纤维素酶与木聚糖酶间协同性研究的需要。

发明内容

本发明的目在于提供一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法，将里氏木霉粗酶制剂溶解于20mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液中，以0.5M NaCl在0.8-1.2mL/min的流速下，使用Mono Q^TM5/50GL阴离子交换柱进行梯度分离，根据紫外吸收峰分别收集11.5-65.5min，70.5-75.7min，75.7-81.0min，81.0-102.5min对应的洗脱组份，即为多糖水解酶，并分别将上述收集组分进一步的纯化，

将根据紫外吸收峰收集11.5-65.5min组分冻干后，溶于0.5-1mL超纯水中，以0.9-1.1mL/min的流速，使用凝胶过滤柱Superdex 75pg层析，收集51.5-55.5min对应的洗脱组份，即为外切葡聚糖酶II(CBH II)；收集58.5-63.5min对应的洗脱组份，即为内切葡聚糖酶II(EG II)；

将根据紫外吸收峰收集70.5-75.7min组分冻干后，溶于0.5-1mL超纯水中，以0.9-1.1mL/min的流速，使用凝胶过滤柱Superdex 75pg层析，收集47.5-51.0min对应的洗脱组份，即为木聚糖酶；收集53.0-61.5min对应的洗脱组份，即为内切葡聚糖酶I(EG I)；

将根据紫外吸收峰收集75.7-81.0min冻干后，溶于0.5-1mL超纯水中，以0.9-1.1mL/min的流速，使用凝胶过滤柱Superdex 200pg层析，收集68.5-74.5min对应的洗脱组份，即为β-木糖苷酶；收集77.0-82.5min对应的洗脱组份，即为β-葡萄糖苷酶(BGL)；

将根据紫外吸收峰收集81.0-102.5min冻干后，溶于0.5-1mL超纯水中，以0.9-1.1mL/min的流速，使用凝胶过滤柱Superdex 75pg层析，收集52.5-62.5min对应的洗脱组份，即为外切葡聚糖酶I(CBH I)。

将所述Mono Q^TM 5/50GL阴离子交换柱以0.8-1.2mL/min的流速，使用20mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液预平衡，待用。将所述凝胶过滤柱Superdex 75pg和凝胶过滤柱Superdex 200pg，以0.9-1.1mL/min的流速，使用TBS预平衡，待用。所述TBS为50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl。所述将里氏木霉粗酶制剂为将里氏木霉培养于以1％水葫芦为唯一碳源的培养基中，而后采用饱和硫酸铵沉淀收集20％-60％饱和度得到沉淀，待用。所述1％水葫芦为唯一碳源的培养基成分：Mandel培养基中添加1％的水葫芦作为唯一碳源。

本发明所具有的优点：本发明从粗酶混合物中分离多种单一酶组份方法简便，且得到较多水解酶组份，所纯化得到的七种单一酶组份均保持有活性

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化七种来自里氏木霉的多糖水解酶的具体流程图。

图2为本发明实施例提供的经阴离子交换层析后得到的洗脱图谱。

图3为本发明实施例提供的经凝胶过滤层析后得到的洗脱图谱。

本发明的目的、优点将结合实施例，参照附图、表进一步说明。

具体实施方式

本发明给出详细具体的分离纯化方法参见流程见图1。