[发明专利]磺胺类药物半抗原及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种磺胺类药物酶联免疫试剂盒检测动物源性样本中磺胺类药物残留的应用，包括步骤：

(1)样品前处理：

鲜牛奶前处理方法：取50μl鲜牛奶样本，加入450μl复溶工作液中，混匀，取50μl用于分析；

鸡肉、猪肉、鱼、虾前处理方法：用均质器均质组织样本后，称取2.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml pH＝6的磷酸盐缓冲液涡动成糊状，再加入6ml乙酸乙酯，振荡1min，4000rpm室温离心5min，取3ml上清液至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干，加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加入1ml复溶工作液，涡动10s，4000rpm室温离心5min，除去上层正己烷相，取下层水相50μl用于分析；

蜂蜜前处理方法：称取1.0±0.05g蜂蜜样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入1ml 1mol/L盐酸溶液，用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解，放入37℃培养箱中孵育30min，取出，加入1ml1mol/L氢氧化钠溶液和1ml pH＝6的磷酸盐缓冲液，再分别加入2ml乙腈和6ml乙酸乙酯，用振荡器振荡1min，4000rpm室温离心10min，取4ml上层有机相至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干，加0.5ml复溶工作液溶解，取50μl用于分析；

尿液前处理方法：取50μl尿液样本，加入150μl洗涤工作液中，混匀，取50μl用于分析；

(2)用试剂盒检测；

(3)检测结果分析；

其特征在于所述试剂盒为检测磺胺类药物的酶联免疫试剂盒，它含有：

(1)包被磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的酶标板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(3)磺胺类药物单克隆抗体工作液；

(4)磺胺嘧啶标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；

(5)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L硫酸；

(7)浓缩洗涤液为pH7.2，含0.8％～1.2％吐温-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐剂、0.1～0.3mol/L的碳酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

(8)浓缩复溶液为pH7.6，含8％～12％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

所述磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的制备方法包括如下步骤：取15mg磺胺类药物半抗原用0.8ml N,N-二甲基甲酰胺溶解，冷却至10℃，得到溶液I；取氯甲酸异丁酯10μl加入I中，10℃搅拌反应30min；取30mg卵清蛋白用2.2ml 50mmol/L Na₂CO₃溶解，10℃反应4h，然后4℃过夜；用0.01mol/L PBS 4℃透析3天，每天换3次透析液，即得到磺胺类药物包被原；

所述磺胺类药物半抗原的合成方法为：a)于25ml单口瓶中加入6-氨基烟酸0.87g，乙醇20ml，12mol/L盐酸3.7ml，加热回流，反应8h，TLC监测，反应完毕，减压除去溶剂，溶于饱和NaHCO₃水溶液，乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥，乙酸乙酯:石油醚＝2:1(v:v)柱层析纯化；b)于25ml单口瓶中加入a)所得产物0.89g，三乙胺1.6ml，CH₂Cl₂ 10ml，搅拌溶解后，加入催化剂4-二甲氨基吡啶，缓慢滴入4-乙酰氨基苯磺酰氯的2ml二氯甲烷溶液，TLC监测，5h，反应完毕后处理，干燥，乙酸乙酯:石油醚＝1:10(v:v)柱层析纯化；c)于25ml单口瓶中加入b)所得产物1g，2mol/L NaOH水溶液120ml，加热回流，TLC监测，反应10h，完毕，调节pH4～5，有固体析出，即为磺胺类药物半抗原，其分子结构式为：

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述磺胺类药物单克隆抗体是由磺胺类药物免疫原免疫动物制备得到的，可以同时检测磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺噻唑、酞酰磺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺吡啶7种磺胺类药物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述磺胺类药物免疫原的制备方法包括如下步骤：

取12mg磺胺类药物半抗原，溶解于1ml N,N-二甲基甲酰胺中，得到溶液I；取15mg碳化二亚胺用0.2ml水充分溶解后加入I中，室温下搅拌24h，得到溶液Ⅱ；称取牛血清白蛋白40mg，使之充分溶解在3ml pH 7.2的PBS中，将溶液Ⅱ逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L PBS 4℃透析3天，每天换3次透析液，即得到磺胺类药物免疫原。