[发明专利]p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法及其在损伤中枢神经再生与功能恢复中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别涉及p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备及应用。

背景技术

中枢神经系统（Central nervous system, CNS）损伤与修复一直是神经科学研究的热点。发育神经生物学及大量移植修复实验证实成年哺乳动物CNS损伤后不仅可再生而且由神经元固有的特性（Intrinsic properties）和其所处的微环境（Environment cues）决定，与周围神经系统损伤后的成功再生相比，CNS再生失败的主要原因是由于损伤微环境中多种再生抑制分子，如Nogo-A、MAG (Myelin-associated glycoprotein)和OMgp（Oligodendrocyte-myelin glycoprotein）的存在。它们均能独立通过Nogo-66 受体（Nogo-66 receptor，NgR）及其下游可能的信号通路参与神经再生的抑制作用。NgR是一种GPI（Glycosyl phosphatidylinositol）锚定膜蛋白，本身无信号转导能力，其下游分子的活化需要其协同受体（Co-receptor）的参与。研究表明中枢神经神经元p75神经营养素受体（p75 neurotrophin receptor, p75NTR）作为NgR的一个协同受体，可通过其细胞外域（Extracellular domain, ED）与NgR碳末端结合介导髓磷脂抑制物对轴突再生的抑制作用。目前虽然p75NTR抑制剂在体外可增强神经元突起的生长，但体内实验却仍未证实其能够促进损伤中枢神经元的轴突再生及功能恢复。

研究表明，体外移植p75NTR高表达的雪旺细胞（Schwann cells, SCs），嗅鞘细胞（Olfactory enshenthing cells, OECs），神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）等均可促进损伤脊髓的轴突再生和功能改善。尽管其作用机制目前尚不清楚，但它们有一个共同特点，即均高表达p75NTR。这些细胞表面高表达的p75NTR在移植于损伤脊髓后可能与再生环境中神经元的NgR-配体复合物发生相互作用，拮抗神经元的NgR信号通路，减少再生抑制分子的抑制效应，进而促进轴突的再生。但靠细胞培养移植治疗脊髓损伤，过程相对复杂，培养成本较高，可操作性不强，很难形成大规模生产。

目前重组蛋白的表达体系主要有真核表达体系和原核表达体系。真核表达体系最常用的为酵母表达体系和哺乳动物细胞表达体系。尽管真核表达体系可产生具有天然立体结构的分泌型蛋白，但真核表达体系也有其致命的缺点。如酵母表达体系糖链与哺乳动物加工不一致，培养上清中糖浓度较高，部分蛋白产物易降解，表达量不可控；再如哺乳动物细胞表达系统表达量通常较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本高，远不能满足未来药物开发的需要。原核表达体系中最常用的为大肠杆菌（Escherichia coli），其遗传背景清楚，基因工程操作简便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高，更重要的是其生产成本低、周期短，适合大规模生产。尽管其表达的蛋白很难进行正确折叠，生物活性较低，但pET原核表达系统通过对载体及宿主的改进，该状况已有较大改观。

发明内容

本发明的目的是提供一种p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法，以提高p75NTR-ED-Fc融合蛋白的表达效率和生物活性。

本发明的另一目的是提供p75NTR-ED-Fc融合蛋白的新用途，具体讲是提供p75NTR-ED-Fc融合蛋白在损伤中枢神经再生与功能恢复中的应用，以促进损伤中枢神经再生与功能恢复。

本发明所述p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法由以下步骤实现：

（1）p75NTR-ED-Fc原核表达载体的构建与鉴定

以真核表达载体pcDNA-p75NTR-ED-Fc质粒为模板，根据Genebank中编号为NM_002507.1的p75NTR核苷酸序列及编号为XM_002348257.1的IgG的Fc段核苷酸序列分别设计特异的p75NTR正向引物和半特异的p75NTR/Fc反向引物，并在引物两端分别引入Kpn I、Xho I酶切位点及相应的保护碱基，经PCR扩增得到p75NTR-ED-Fc片段，引物序列如下：

Forward primer: 5' CGGGGTACCATGGGGGCAGGTGCCACC 3'

Kpn I酶切位点