[发明专利]一种重组海参溶菌酶N端多肽、其制备方法和应用

权利要求书

1.重组海参溶菌酶N端多肽的引物序列，其特征在于：引物序列分别为，正向引物：SEQ ID NO：1；反向引物：SEQ ID NO：2。

2.一种重组海参溶菌酶N端多肽的质粒，其特征在于，制备方法包括：以溶菌酶SjLys基因为模板，将权利要求1所述的引物序列所扩增的基因片段连接至大肠杆菌表达载体pET32a(+)中，构建重组表达质粒。

3.一种表达重组海参溶菌酶N端多肽的基因工程菌，其特征在于，制备方法包括：将权利要求2所述的质粒转化Rosetta(DE3)pLysS宿主细胞获得重组基因工程菌。

4.一种重组海参溶菌酶N端多肽的制备方法，其特征在于，制备方法包括：

①诱导表达：培养权利要求3所述的重组基因工程菌，并用IPTG诱导表达；

②分离和纯化：收集步骤①所得产品，经镍离子亲和层析柱纯化，并用超滤膜浓缩；再将浓缩样品脱盐后制得终产品。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，诱导表达和分离纯化的条件包括：

③诱导表达

将权利要求3所述的重组基因工程菌在优化的液体培养基中，37℃、160rpm振荡培养至OD₆₀₀达0.6-0.8，再向培养体系中加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，28℃、150rpm诱导培养8h，收集发酵液；

其中，优化的液体培养基是指：在LB培养基中加入两种抗生素，即100mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素，并添加5g/L葡萄糖，0.3g/L MgSO₄·7H₂O和1g/L K₂HPO₄·3H₂O；

④分离和纯化

将步骤③收集的发酵液离心，收集并洗涤菌体，反复冻融，用磷酸盐缓冲液重悬菌体，并加入Triton X-100至终浓度为1％后，经冰浴超声破菌，离心收集上清液，经镍离子亲和层析柱His Trap HP column纯化，收集重组海参溶菌酶多肽的融合蛋白组分，用截留分子量为5kDa的Millipore超滤膜将蛋白浓缩至8～10mg/mL；再将浓缩样品经Sephadex G-25凝胶层析脱盐，收集融合蛋白组分，冷冻干燥，得到重组海参溶菌酶N端多肽的产品。

6.根据权利要求4或5所述的方法获得的重组海参溶菌酶N端多肽。

7.如权利要求6所述的重组海参溶菌酶N端多肽在制备饲料添加剂、食品防腐剂、抗生素的替代药物、海水养殖生产领域中的应用。