[发明专利]一种高密度培养枯草芽孢杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，更具体涉及一种高密度培养枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的方法。

技术背景

抗生素作为饲料添加剂，在畜禽防疫方面虽起到积极的作用，但抗生素的广泛使用带来了环境污染、残毒危害、病菌抗药、人畜安全受到威胁等一系列问题。另外，抗菌素会抑制和杀死肠道内的有益菌群，造成肠道正常菌群微生态失调，导致疫病的发生，出现二重感染，有害于人畜健康。1974年，Parker 提出与“抗生素”相对的新概念——“益生菌”。益生菌，源于希腊语“对生命有益”，是指能定植于宿主肠道内，产生确切健康功效的活的有益微生物的总称，是具有调节动物肠道微生态平衡，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物。

近年来许多研究发现，芽孢杆菌对动物和人的病原菌具有显著的拮抗作用，引起广大微生物和免疫学工作者的密切关注。芽孢杆菌的芽孢具有耐热、抗干燥、便于运输和使用等优点，在西方国家芽孢杆菌已被开始应用于人的功能性食品和动物饲料添加剂。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属的一种，革兰氏阳性需氧菌，是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，因其无毒、无残留、无污染，同时具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，对改善动物消化道微环境、促进动物营养的消化吸收、提高动物饲料的转化率和增强畜禽免疫力起到重要作用，已被越来越多地研制成饲用微生态制剂，广泛应用于畜牧业、饲料等行业。

目前对枯草芽孢杆菌的研究主要集中在抑菌作用、抑菌物质的分离纯化与表征、以及枯草芽孢杆菌的产酶特性和在豆粕中的应用效果研究等，而在提高枯草芽孢杆菌菌体产量的发酵技术方面则报道较少。

发明内容

本发明提供了一种高密度培养枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的方法，以提高枯草芽孢杆菌的菌体产量。

本发明提供的高密度培养枯草芽孢杆菌的方法，具体如下：以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养。

发酵培养基为：可溶性淀粉 12.5-17.5g/L、蛋白胨 20-25 g/L、NaCl 1.5-2.75 g/L、Na₂HPO₄ 0.25-0.75g/L、MgSO₄ 0.25-0.75g/L，pH6.0-8.0；培养条件：培养温度35-45℃、转速150-200r/min、装液量60-100mL/250mL；接种量为5-10%（v/v），培养时间16-18h。

更优选地，发酵培养基为：可溶性淀粉 15g/L、蛋白胨 22.5g/L、NaCl 2.5g/L、Na₂HPO₄ 0.5g/L、MgSO₄ 0.5g/L，pH7.0；培养温度37℃、转速200r/min、装液量80mL/250mL；接种量为5%（v/v），培养时间16h。

所述活化采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，琼脂15g-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，37℃活化24h。     

经过以上条件优化，枯草芽孢杆菌的细胞生物量可达4.32×10⁹cfu/mL，比优化前（1.33×10⁸cfu/mL）提高了31.48倍。

本发明的显著优点：枯草芽孢杆菌是一种非常有应用价值和市场前景的微生态制剂，但在实际应用过程中仍然存在一些问题。在自然条件下的枯草芽孢杆菌，作用效果常常不理想，因此，要对其进行改良，使其在加工工艺、剂型和贮藏技术等环节上有所突破。本发明通过对培养基配方及培养条件的研究，为枯草芽孢杆菌的工业化发酵生产以及进一步开发利用打下基础。

附图说明

图1 枯草芽孢杆菌的生长曲线；

图2  不同碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响；

图3  可溶性淀粉添加量对枯草芽孢杆菌生长的影响；

图4  不同氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响；

图5  蛋白胨添加量对枯草芽孢杆菌生长的影响；

图6  不同无机盐种类对枯草芽孢杆菌生长的影响；

图7  培养基初始pH值对枯草芽孢杆菌生长的影响；

图8  培养温度对枯草芽孢杆菌生长的影响；

图9  转速对枯草芽孢杆菌生长的影响；