[发明专利]一株产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌

说明书

技术领域

本发明涉及一株厌氧条件下发酵高产琥珀酸的微生物菌株(F3-ZK)的选育，以及发酵产琥珀酸过程，属生物技术领域。

背景技术

琥珀酸，学名丁二酸，因最早于琥珀中发现而得名。作为一种重要的C4平台化合物，广泛应用于医药、食品、可降解塑料和化学工业。琥珀酸主要是通过来源于石化原料的顺丁烯二酐水解得到。由于石化资源的不可再生和石化工业对环境产生的负面影响，发酵法生产琥珀酸作为一种新兴的绿色工艺，已成为近年来研究的热点。

发酵法生产琥珀酸具有低碳、清洁环保的特点，符合可持续发展的要求。其中选育高产琥珀酸菌株是实现发酵法生产琥珀酸工业化的关键一环。目前，已报道发酵法生产琥珀酸的微生物菌株有：产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）、产琥珀酸厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）、产琥珀酸曼氏溶血杆菌（Mannheimia Succiniciproducens）、大肠杆菌（E.coli）和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutanicum）。早期研究较为成功的严格厌氧螺菌Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC 29305，其产琥珀酸可达43g/L，产率91%（US 5,143,833；US 5,143,834和US 5,168,055）；密歇根大学和密歇根生物技术研究所筛选的兼性厌氧菌Bacterium 130Z (Actinobacillus succinogenes ATCC 55618)，产琥珀酸含量可达70g/L，产率80%（US 5,04,004，1996；US 5,723,322，1998），其最高研究水平发酵78h产酸达到106.8 g/L，对葡萄糖产率83％（US 5573931, 1996）；韩国科学技术研究院研究组筛选曼氏琥珀酸杆菌Mannheimia succiniciproducens，报道的最高产琥珀酸水平为52.4 g/L，生产强度1.8 g/L·h，（S. J. Lee et al. Appl Envi Microbiol, 2006）。美国阿贡国家实验室M. I. Donnelly等、南伊利诺斯州大学的Clark DP等研究组、乔治亚大学的Mark A. Eiteman研究组等研究构建大肠杆菌基因工程菌，其中E.coli AFP111/pTrc99A- pyc最高水平产酸99.2 g/L（Vemuri G N et al. J Ind Microbiol Biotechnol, 2002）。但是，上述有生产前景的菌株受专利保护，不易获得。

中国专利CN 1884484A公布了一株Actinobacillus succinogenes NJ113，编号为CGMCC NO.171, 其产琥珀酸可达38.5 g/L；中国专利CN1884484A公布了一株高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.3991，其发酵液最高产琥珀酸35.8g/L。本研究小组前期从牛的瘤胃中筛选到一株产琥珀酸的野生菌株，通过菌种鉴定确认为产琥珀酸放线杆菌CGMCC 1593（中国专利ZL 200610038113.6）；通过NTG诱变选育氟乙酸钠抗性突变株，得到产量提高的诱变菌株SF-9（工业微生物，2007,37(2)1-7），其5L发酵罐中发酵36h可积累琥珀酸40.5g/L，应用基因组改组技术选育到耐钠、氟乙酸钠抗性改组菌CGMCC 2653（即F₃-10，中国专利ZL 200810146688.9），该菌株在5L发酵罐中补料分批发酵48h产琥珀酸53.96g/L。2009年报道了采用基因组改组技术选育耐酸性琥珀酸放线杆菌F₃-21，其在5L发酵罐中补料分批发酵72h产琥珀酸达到67.4g/L（微生物学通报，2009，36（11）：1676-1681）。但是这些菌株的产琥珀酸水平多数达不到70g/L，生产强度在1.3 g/(L·h)以下，应用于工业化生产的成本相对还是偏高。

本发明针对上述问题，在前期工作的基础上，采用基因组改组技术，通过改进筛选方法，选育到高产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌F3-ZK，其产酸水平为70-95.6 g/L。比出发菌株F₃-21产酸提高41.8%，生产强度提高111.7%，糖酸转化率提高9.2%。该菌株具有高产、降低生产成本的优势。

发明内容