[发明专利]一种牡丹不定芽诱导方法

说明书

背景技术

本发明涉及一种牡丹的培育方法，尤其涉及一种牡丹不定芽诱导方法。

技术领域

牡丹为我国国花，花大色艳，雍容华贵，也为世人普遍喜爱，但牡丹主要靠分株或嫁接繁殖，繁殖系数低，繁殖速度慢，不能满足实际需要。目前，对于牡丹快繁的研究，多数是采用茎尖或休眠芽为外植体，该方法没有通过细胞脱分化和再分化，属于微扦插，繁殖系数低，获得的幼苗主要因生根困难和移栽成活率低，难以在生产中推广应用。

已有文献采用不定芽再生的途径，但外植体一般选用成熟胚、种子或幼苗。李玉花(2005)建立了牡丹‘凤丹白’子叶再生体系；肖晓蓬(2008)以多花野牡丹种子为外植体成功建立了快繁体系；刘磊(2009)建立了牡丹‘凤丹白’成熟胚经愈伤组织途径分化不定芽的完整再生体系，上述方式均来源于种子的再生体系，存在变异，不能保持牡丹原有品种的特性。

Beruto，et al(2004)采用牡丹花瓣和花丝为外植体，仅花瓣或花瓣产生的愈伤组织在TDZ诱导下获得了不定芽的再生，此种方式玻璃化现象较严重，难以形成完成的不定芽。

发明内容

本发明的目的在于提供一种再生率高的牡丹不定芽诱导方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种牡丹不定芽诱导方法，以NAA和6-BA为诱导剂，以花托为外植体进行诱导培育。

本发明的牡丹不定芽诱导方法具体包括以下步骤：以牡丹幼嫩花蕾，除去萼片后，用70％酒精浸泡15-25sec，清洗一次，经浸泡液浸泡8-20min后，无菌水洗3-5次，每次2-4min；以花托作为外植体接种，接种到MS培养基添加1.5-2.5mg·L^-16-苄基嘌呤6-BA+0.1-0.3mg·L^-1萘乙酸NAA，蔗糖25-35g·L^-1，琼脂7-8g·L^-1，pH调至5.8，每天光照14h，光照强度3000lux，温度25℃，每30天转接入新鲜培养基。

所述的新鲜培养基为MS培养基中添加了1.5-2.5mg·L^-16-苄基嘌呤6-BA+0.1-0.3mg·L^-1萘乙酸NAA，蔗糖25-35g·L^-1，琼脂7-8g·L^-1。

所述的清洗为采用无菌水进行清洗。

所述的浸泡液为0.1％的HgCl₂或2％的次氯酸钠。

本发明采用萘乙酸(NAA)和6-苄基嘌呤(6-BA)为诱导，以花托为外植体，花托营养含量丰富，酶类活性高，不定芽再生率较高，可达到100-490.91％，且玻璃化现象不严重，能够模化生产或基因转化。

具体实施方式

实施例1

本实施例的方法具体步骤为：选择牡丹幼嫩花蕾，除去萼片后，70％酒精浸泡20sec，然后无菌水洗一次，经0.1％的HgCl₂浸泡10min后，无菌水洗4次，每次3min。置吸水纸上把饼状的花托分为4份，作为外植体接种；接种到MS培养基添加2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA，蔗糖30g·L-1，琼脂7.5g·L-1，pH调至5.8；每天光照14h，光照强度3000lux，温度25℃；每30天转接入新鲜培养基，经过7周的诱导培养，部分牡丹品种的不定芽诱导生成率达100％。

实施例2

本实施例的方法具体步骤为：以牡丹幼嫩花蕾，除去萼片后，用70％酒精浸泡15sec，清洗一次，经0.1％的HgCl₂浸泡15min后，无菌水洗3次，每次2min；以花托作为外植体接种，接种到MS培养基添加1.5mg·L^-16-苄基嘌呤6-BA+0.1mg·L^-1萘乙酸NAA，蔗糖25g·L^-1，琼脂7g·L^-1，pH调至5.8，每天光照14h，光照强度3000lux，温度25℃，每30天转接入新鲜培养基。经过7周的诱导培养，部分牡丹品种的不定芽诱导生成率达330％。

实施例3

本实施例的方法具体步骤为：以牡丹幼嫩花蕾，除去萼片后，用70％酒精浸泡25sec，清洗一次，经浸泡液浸泡20min后，无菌水洗5次，每次4min；以花托作为外植体接种，接种到MS培养基添加2.5mg·L^-16-苄基嘌呤6-BA+0.3mg·L^-1萘乙酸NAA，蔗糖35g·L^-1，琼脂8g·L^-1，pH调至5.8，每天光照14h，光照强度3000lux，温度25℃，每30天转接入新鲜培养基。经过7周的诱导培养，部分牡丹品种的不定芽诱导生成率达490.91％。