[发明专利]一种以银杏内生解淀粉芽孢杆菌制备微生物杀菌剂的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种杀菌剂的生产方法，尤其是一种以银杏内生解淀粉芽孢杆菌制备微生物杀菌剂的生产方法。

背景技术

杨树是一种速生丰产树种，在我国广泛种植，资源较为丰富。但杨木纤维结构疏松，砍伐后易受变色真菌侵蚀，产生变色，严重影响木材的美观，大大降低了其经济价值。已有的研究表明，变色菌可可球二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）和新月弯孢（Curvularia lunata）是导致杨木变色的主要原因。其中L. theobromae因生长速度快，变色迅速的特点，影响了杨树的价值。目前，从自然界中筛选出的可用于防治木材蓝变的细菌有土霉素链霉菌（Streptomyces rimosus）及粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。芽孢杆菌因其种类繁多，功能也各不相同，具有营养简单、生长快速、易分离、能产生多种活性代谢产物的特点，已成为生物杀菌剂的首选菌种，而且在逆境环境下能产生芽孢，有利于生物农药的开发、生产和应用。

银杏内生解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens CGMCC 5569（B.A. 5569）菌株具有如下的细菌学特性：

1、形态特征

（1）菌落特征

在NB或者LB培养基上生长，菌落呈淡黄色近似圆形、表面干燥、有褶皱、不透明、有一定黏度、带特殊的臭味。

（2）菌体特征

革兰氏反应为阳性；可形成内生芽孢，芽孢中生，为椭圆形，稍膨大。电镜下观察，菌体呈杆状，大小为2μm×0.6μm，以二分裂方式进行繁殖。

、生化特性

注：＋：表示反应呈阳性；－：表示反应呈阴性；±：表示反应呈弱阳性。

、对杨木变色真菌抑菌活性好

该菌发酵液和乙酸乙酯相浸膏对三种变色真菌抑制情况见附图

4、菌株鉴定

基因组 DNA 提取后，利用 16S rRNA 通用引物对其进行 PCR扩增，回收扩增产物并测序，然后对菌株16S rRNA序列在NCBI网站中进行同源性比较。结果表明：16S rRNA保守序列为1489bp；在EzTaxon数据库中进行有效种序列相似性比对（下图），发现和芽孢杆菌属的有效种B. amyloliquefaciens NBRC 15535相似性最高（相似性为99.313%），其次为B. subtilis subsp.Inaquosorum（相似性为99.229%）和芽孢杆菌Bacillus tequilensis（相似性为99.313%）。基于16S rRNA基因序列系统发育分析，发现菌株B.A.5569与解淀粉芽孢杆菌独成一个分支，并且自举值相对较高，同时结合菌落特征、菌体形态的观察以及生理生化实验结果，可以确定菌株B.A.5569为解淀粉芽孢杆菌的一个菌株。

解淀粉芽孢杆菌B. A. 5569具有以下优点：

1、广谱性好

对小麦赤霉病菌Fusarium graminerum，油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum，水稻立枯丝核菌Rhizoctonia solani，苹果轮纹病菌Botryosphaeria berengeriana，棉花黄萎病真菌Verticillium dahlia有明显的防治效果。尤其在杨木变色真菌防治方面具有突出效果（见附图）

 2、对杨木变色真菌抑制率高

在发酵液1.0mL/mL和乙酸乙酯相浸膏100μg/mL时，对三株杨木变色真菌抑制率达到65%以上。

、适应范围广

在-18℃~50℃范围内均能存活，对盐浓度有一定的耐受性。

、发酵周期短

发酵时间在72小时以内完成。

发明内容