[发明专利]一种抗血栓酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明公开了一种新的具有抗血栓作用的酶及其编码的基因，以及该酶的制备方法和应用，属于生物医学领域。

技术背景

大量研究资料表明，血栓性疾病已成为危害人群健康的重要因素，其发病率高居各种疾病之首，且近年来还有渐增之势。现在抗血栓药和心血管病人的关系越来越密切，但现在的许多抗血栓药物带来出血和血压低等潜在的风险，因此寻求更具潜力和更加安全的新型的药物分子就显得尤为重要。

抗血栓药物主要以抗凝和溶栓两种方式起治疗作用，各有优缺点。抗凝药以肝素为代表，而溶栓药以尿激酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂为代表。血栓是多种疾病的成因。目前用于治疗非冠状血管疾病的药物有链激酶(sK)，尿激酶(UK)和重组型组织纤维蛋白溶酶原激活剂(rtPA)等。

随着生化提取技术的发展，基因重组等生物技术的引入，产品将不断推陈出新。姚虻是一种用于活血通经、软坚散瘀的中药材，其药用历史悠久，本研究从姚虻的唾液分泌物中提取单一有效的蛋白，并利用基因工程表达该蛋白，其药效和药理具有显著的效果。赖仞等从牛虻的提取出的一种抗血栓酶tabfiblysin(专利号：200910094685X)，并且研究了其抗血栓的作用。

发明内容

本技术主要包括，一种从姚虻中获取的新的抗血栓酶及其编码的基因获得、大肠杆菌制备抗血栓酶的方法和该蛋白在抗血栓方面的应用。

根据N端和C端的测序结果和密码子的偏爱性，设计引物获得编码蛋白的核苷酸序列。该抗血栓酶基因的获得包括：mRNA的提取，RT-PCR获取目的基因、基因构建到PBV220-载体及测序。将得到的阳性克隆，进行诱导表达和纯化，最终得到重组的抗血栓酶。该蛋白酶可以用于制备注射、口服等多种给药途径的药物制剂。

本发明对抗血栓酶的药理作用进行了研究，研究结果表明：该蛋白具有抗血小板聚集的作用；该蛋白对纤维蛋白凝块的具有溶解的作用，30μg/L的作用强度和10单位的尿激酶的作用相当；受试物Kfpase-1蛋白具有明显的抗栓作用，能延长电刺激引起的动脉血栓形成时间。同时在实验中我们意外的发现：本发明方案获得的酶较文献(专利号：200910094685X)方法制得的酶抗血栓效果更强，我们推测，与其不同的氨基酸位点可能处于其活性部位，不同的结构最终影响了其药效。本发明的抗血栓酶具有良好的抗凝、抗血小板以及抗栓活性，在临床可以广泛的应用于己于心脑血管疾病领域。

技术方案

本发明所提供的抗血栓酶，名称为Kfpase-1，经过纯化后，质谱分析其分子量大小约为26028Da。并对其进行测序，根据N端和C端的测序结果和密码子的偏爱性，设计引物获得编码蛋白的核苷酸序列

该抗血栓酶基因的获得包括：mRNA的提取，RT-PCR获取目的基因、基因构建到PBV220-载体及测序。

将得到的阳性克隆，进行诱导表达和纯化，最终得到重组的抗血栓酶

本发明提供了重组技术制备该抗血栓酶的方法。

本发明还提供了一种具有溶栓，抗血小板聚集，抗血栓形成作用的药物。

本发明所提供的药物，其活性成份为抗血栓酶Kfpase-1，需要的时候该药物中可以加入一种或者多种药学上可以接受的载体，所述的载体包括药学领域常用的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。

本发明的药物可以制备成注射液、粉针剂、片剂、胶囊、口服液等多种形式。上述的各种剂型均可以参照药学领域制剂的常规方法进行。

本发明利用基因重组技术制备的抗血栓酶药效实验显示，该酶具有水解纤维蛋白酶原和抑制血小板凝聚的作用，在大鼠实验中能明显抑制动脉血栓形成。故可作为抗血栓的候选药物来治疗临床上各种因血栓类疾病，包括心肌梗死、脑卒中、动脉循环障碍性疾病、冠心病、静脉血栓、PCI手术后的抗栓治疗等。在医学领域着极其广阔的前景。

附图说明：

图1.Sephadex G-75凝胶洗脱峰图

图2.SPSepharose离子交换洗脱峰

图3.提取的活性蛋白HPLC纯度分析图

图4.重组目的蛋白SDS-PAGE图片

具体实施例：

实施例1、从姚虻中提取天然活性蛋白

1.将姚虻用剪刀破开后用20mMTris-HClpH8.0充分浸泡，在4℃搅拌2hr，12000rpm 4℃离心10min，弃去沉淀，在20mM Tris-HClpH8.0中透析12hr，