[发明专利]疟原虫抗体胶体金检测试剂盒及其制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测用试剂盒，具体涉及一种疟原虫抗体胶体金检测试剂盒及其制备。

背景技术

疟疾(Malaria)是由热带、亚热带的一种蚊叮咬传播疟原虫而引起的，不同的疟原虫分别引起间日疟、三日疟、恶性疟及卵圆疟。本病主要表现为周期性规律发作，全身发冷、发热、多汗，长期多次发作后，可引起贫血和脾肿大。疟疾于夏秋季发病较多，在热带及亚热带地区一年四季都可以发病，并且容易流行。在亚洲和非洲地区疟疾仍然是威胁和危害人们健康最为严重的寄生虫疾病之一。目前，全球仍有1.2亿疟疾患者，带虫者约3亿，非洲每年还有百万儿童死于疟疾。

富组蛋白(HRP-II)是恶性疟原虫消化血红蛋白后形成的代谢产物，由血液期无性体和早期配子体合成，含有大量组氨酸，具有种特异性，由于是水溶性抗原其可在疟疾患者的血浆、尿、全血中检测到，是诊断恶性虐的理想靶位；疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)是疟原虫体内代谢酶，红内期疟原虫无性期和配子体期均有表达，其物理生化、免疫学特性、酶催化作用等与人体红细胞和其他许多微生物的乳酸脱氢酶差异性大，可以作为免疫诊断的靶抗原。

目前诊断疟疾的金标准仍是传统的血膜染色镜检法，且作为疟疾确诊最重要的标准。该法是用普通手动移片和对焦的生物显微镜，镜检人员常因眼睛疲劳而导致读片准确性降低、工作效率低。以纳米胶体金为标记物的免疫层析技术发展很成熟，但现有的疟疾检测试剂盒采用的单克隆抗体只能检测一种抗原，或者是将几种抗体简单结合于检测区，增加了生产的复杂度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种含双特异性单克隆抗体的疟原虫抗体胶体金检测试剂盒，实现疟疾(Malaria)的灵敏、特异、快速的检测。

本发明首先提供了一种疟原虫抗体胶体金检测试剂盒，包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗HRP II特异性单克隆抗体和抗pLDH特异性单克隆抗体、质控区(C)喷点有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。

较佳的，所述胶体金标记的HRPII-pLDH双特异性单克隆抗体中，胶体金为粒径39-42nm的球形颗粒。

本发明的另一方面，提供了这种疟原虫抗体胶体金检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)用两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金；

2)采用步骤1制得的胶体金标记HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体获得免疫胶体金；

3)采用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂经预处理的玻璃纤维垫片，制得免疫胶体金纸片；

4)在硝酸纤维素膜的检测线喷点抗HRP II特异性单克隆抗体和抗pLDH特异性单克隆抗体的混合液，在质控线上喷点羊抗鼠免疫球蛋白IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；

5)将滤样纸、步骤3制备的免疫胶体金纸片、步骤4制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条；最后将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒。

步骤1)所述两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金具体包括下列步骤：

a)第一次还原氯金酸溶液：

制备浓度为0.0004-0.0005mol/L的HAuCl₄水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl₄与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶(8-9)，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，既制得14～16nm粒径的胶体金原溶液。

b)第二次还原氯金酸溶液：

将第一步制得的胶体金原溶液放置于4.0-4.5℃恒温冰浴中稳定温度，随后按胶体金原溶液与HAuCl₄水溶液体积比1∶(1.9-2.0)加入4.0-4.5℃的0.003-0.004mol/L HAuCl₄水溶液，随后立即边搅拌边滴加4.0-4.5℃的抗坏血酸与PVP(聚乙烯醇吡咯烷酮)的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl₄的摩尔比为(25-26)∶1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl₄的重量比为1∶(2.0-2.1)，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，既制得39-42nm粒径的胶体金溶液。

两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。