[发明专利]一种快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，属于核酸应用技术领域。

背景技术

基因组是指包含在该生物的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，以下简称DNA)[部分病毒是核糖核酸(Ribonucleic acid，以下简称RNA)]中的全部遗传信息。更精确的讲，基因组指的是一套染色体中的完整的DNA序列。研究生物基因组和如何利用基因的一门学问则就叫基因组学。

随着基因组学等分子生物学研究的发展，利用大片段DNA的研究步入了一个重要的位置。大片段D N A在测序，图位克隆基因、基因结构及其功能分析等研究具有重要作用。

传统获得大片段基因组脱氧核糖核酸一般采用十六烷基三甲基溴化铵法(即CTAB法，以下简称CTAB法)，CTAB法虽然经过繁琐操作可以获得大片段基因组脱氧核糖核酸，但操作过程麻烦，且中间过程需要进行有机抽提，不仅对人体有害，也会对环境造成污染。

发明内容

本发明的目的是提出一种快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，简化脱氧核糖核酸的提取工艺，而且不需接触有机试剂，以便安全、快速地获得大片段基因组脱氧核糖核酸用于基因组学研究。

本发明提出的快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，包括以下步骤：

(1)向含抗凝剂的血液中加入体积为血液初始体积1-2倍的缓冲液A，颠倒混匀5次，得到第一混合液，对第一混合液进行离心分离，在2000×g离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀，所述的缓冲液A的组成为：柠檬酸钠75-150毫摩尔/升，吐温-20质量体积比为2-10％，采用柠檬酸调pH值至7.0；

(2)在上述细胞沉淀中加入体积为血液初始体积1-2倍的缓冲液A，颠倒混匀5次，得到第二混合液，对第二混合液进行离心分离，在2000×g离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保细胞沉淀在管中；

(3)配制缓冲液B和蛋白酶K的混合液，缓冲液B和蛋白酶K的体积比为100∶1，得到第三混合液，所述的缓冲液B的组成为：盐酸胍2-4摩尔/升，pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸10-50毫摩尔/升，采用盐酸调pH值7.0；

(4)在上述步骤(2)的细胞沉淀中加入体积为血液初始体积1/2的第三混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块，得到第四混合液；

(5)将第四混合液于65摄氏度水浴10-30分钟，同时颠倒混匀数次；

(6)向第四混合液中加入体积为血液初始体积1/2的异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组脱氧核糖核酸，得到第五混合液；

(7)对第五混合液进行离心分离，在2000×g离心分离3分钟，倒弃上清液，留下脱氧核糖核酸沉淀，将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保脱氧核糖核酸沉淀在管中；

(8)在上述步骤(7)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为血液初始体积1/2、体积百分比浓度为70％的乙醇，涡旋振荡5秒钟，在2000×g离心分离3分钟，倒弃上清液；

(9)重复步骤(8)，最后将离心管倒置在干净的吸水纸上停留5分钟以上，使脱氧核糖核酸沉淀在管中；

(10)在空气中使步骤(9)的脱氧核糖核酸沉淀干燥5分钟以上，直至所有的液体挥发干净；

(11)在上述步骤(10)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为血液初始体积1/10的洗脱缓冲液C，低速涡旋5秒，65摄氏度加热1小时，溶解后即脱氧核糖核酸溶液，所述的缓冲液C的组成为：pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸10毫摩尔/升，pH值为8.0的乙二胺四乙酸二钠盐1毫摩尔/升。

本发明提出的快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，其优点是安全快速、获得DNA片段大。不同于传统CTAB法，本发明方法的操作步骤简便，而且不涉及有机抽提，无需使用对人体有害的有机物质。本发明方法是基于调整盐浓度和pH值的原理，所开发的快速大片段DNA提取技术，可用于基因组的多项研究，不仅节省了大量时间，同时获得了高质量的大片段DNA。使用本发明方法提取的大片段基因组脱氧核糖核酸，具有较高的纯度，操作过程中杂质残留降到最低；而且产量高，可满足下游的多种应用。

附图说明

图1是本发明方法的一个实施例中提取的1ml血液基因组脱氧核糖核酸的电泳图。

图2是本发明方法的另一个实施例中提取的5ml血液基因组脱氧核糖核酸的电泳图。

具体实施方式

本发明提出的快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，包括以下步骤：