[发明专利]一种利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法，属于核酸纯化领域。

背景技术

植物RNA的提取是进行植物分子生物学研究的一个重要前提。RT-PCR、Northern、Real-time PCR、cDNA文库构建等分子生物学研究的开展都需要纯度高、完整性好的总RNA。很多植物或植物器官体内含有大量的多糖类、酚类以及次级代谢产物，或内源RNase含量较高，使得提取这些植物的RNA相对比较困难。多糖的理化性质与RNA相似，在提取过程中容易与RNA一起形成胶状沉淀，在后续的反转录等实验中明显影响实验效果。而酚类物质在提取过程中容易氧化成醌类物质并与RNA形成不可逆的结合，从而大大降低RNA的活性。在植物果实的发育过程中，包括RNase在内的各种水解酶大量积累，同时富集多种次级代谢产物。这些都严重影响RNA提取的质量和得率。

目前提取RNA的方法较多，有TRIzol法、CTAB-LiCl法、异硫氰酸胍法和热硼酸法等。TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。TRIzol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用，但是该法操作步骤繁琐，提取富含多糖多酚植物材料RNA的效果不佳。CTAB-LiCl法常被用来提取富含多糖多酚材料的RNA，CTAB可与RNA以及DNA形成不溶的复合物，有利于去除多糖，但CTAB法通常要结合其它操作，如再经LiCl沉淀等步骤，使得该法操作繁琐。硅胶膜吸附法为大多数生物公司所采用，它的裂解液主要基于高浓度的胍盐充分裂解细胞，β-巯基乙醇抑制RNase活性，保护RNA不被降解。如国外知名生物公司Qiagen的RNeasy PlantMini Kit，该试剂盒对大部分植物材料都适用，具有得率高，速度快，纯度高等特点，但对富含多糖材料RNA的提取效果不理想。因此，开发一种应用范围广、快速、成功率高的提取多糖多酚植物RNA的方法对于提高实验效率非常必要。

发明内容

本发明的目的是提出一种采用新的多糖多酚植物裂解液并结合硅胶膜法从多糖多酚植物中纯化总核糖核酸的方法，该多糖多酚植物裂解液可以有效抑制RNase活性，多酚氧化酶活性，沉淀多糖，并可以提供一种有利于和硅胶膜结合的高盐低pH环境。

本发明提出的利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法，包括以下各步骤：

(1)向50～100毫克经液氮研磨的植物组织中加入500微升多糖多酚植物裂解液，涡旋剧烈震荡混匀；

(2)将上述混合物室温放置5分钟后进行离心分离，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离时间为2分钟，取出离心分离的上清液；

(3)将步骤(2)中的上清液转入过滤柱中，进行过滤离心，离心过滤时间为1分钟，吸取收集管中的上清液至无核糖核酸酶的离心管中；

(4)在步骤(3)的溶液中加入200微升无水乙醇，混匀后转入硅胶膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为12000转/分钟，离心吸附时间为1分钟，倒去废液；

(5)向步骤(4)的硅胶膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，进行第一次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；

(6)向步骤(5)的硅胶膜吸附柱中加入活性单位为0.375库尼茨的脱氧核糖核酸酶溶液80微升，室温下放置15分钟后，再加入350微升去蛋白液，进行第二次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；

(7)向步骤(6)的硅胶膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为15秒，倒去废液；重复该步骤一次；

(8)对步骤(7)的硅胶膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；

(9)在步骤(8)的硅胶膜吸附柱中加入30～50微升无核糖核酸酶的水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到核糖核酸溶液。

本发明方法中，所述的多糖多酚植物裂解液中的各组分为：

将上述各组分称重后混合，加去离子水，使混合液体积为1000毫升。

本发明提出利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法，其优点是：