[发明专利]一种以微、纳磁为基础的基因芯片检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因芯片检测方法，尤其是在生物芯片、蛋白质等生物大分子的微阵列领域进行基因芯片检测的方法。 

背景技术

基因芯片(或称DNA微阵列)技术在生物检测、疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的意义，是目前发展较快的一种高通量筛选技术。它是把大量已知序列的寡核苷酸探针集成在同一个基片上(如玻璃、尼龙膜等载体)，然后将标记好同位素、酶或荧光等的若干靶核苷酸序列与芯片特定位点上的探针杂交，接着利用各种成像技术，将标记杂交后的信号读出，最后对生物细胞或组织中大量的基因信息进行分析的一套检测系统。 

因此，如何对靶核苷酸序列进行标记及如何读出杂交后的标记信号对发展高通量、操作简单及成本较低等优点的基因芯片检测技术具有十分重要的作用。在生物分子标记与检测方面，尽管传统同位素标记法灵敏度高，但空间分辨率低，另外，同位素扫描成像系统与反应物需特殊处理防止辐射污染。而酶标记法的使用过程中需要一些生色底物，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶均要对应的生色底物。因此，尽管其检测系统为CCD，成本低，但只能适用一些多孔检测板(如96孔板)等低密度检测。而荧光标记是目前应用最为广泛的一种技术，被国际上Affymetrix公司等重要生物芯片制备公司所采用。特别是激光共聚焦显微扫描技术的发展，可以对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。因为探针与样品完全正常配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的5-35倍。使用时只要将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为5-10μm。同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。通过计算机控制传动平台X-Y方向上步进平移，DNA芯片被逐点照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成20μm象素的图像。但荧光分子容易出现光漂白现象、动力学范围窄，另外，所涉荧 光扫描仪因需要精密的光学系统而出现成本高等缺点。因此，如何结合不同生物分子标记方法的探索，对大量的信息进行简单、价格便宜地解读，仍是科学家的梦想，是目前的一个艰巨的技术问题。 

受纳米材料技术发展影响，利用纳、微米级的超顺磁性颗粒进行生物分子标记，然后将生物识别过程中产生的磁信号转化为电信号进行检测就是这方面的一个重要尝试。如1998年，美国海军实验室(NRL)率先提出利用GMR效应(它是指材料的电阻率随着材料磁化状态的变化而呈现显著改变)和免疫磁标记实现GMR生物传感器的设想，并通过测量DNA、抗原-抗体等实验，证明了其方案的可行性。随后，他们发展了用于计量标记磁珠的“磁标记阵列计数器”BARCI。该DNA阵列芯片由尺寸为80μm×20μm的64个GMR传感磁条构成8个传感区构成，随后他们又将传感器的长宽比提高到80μm×5μm。2002年，德国Schotter等为进一步提高磁性颗粒在传感器上的覆盖度，进一步将传感器磁条设计为螺旋型。该结构不仅大幅度地扩大了传感器的长宽比，改善了信噪比值，同时由于使用了尺寸更小的磁珠(直径0.35μm)，使得单位探测面积内所富集的标记磁珠更多，从而扩大了探测的有效作用区域。受此启发，2003年，NRL又推出了BARCIII，即80mm×1.6μm螺旋型GMR传感器，同时将磁条电阻增加到42kΩ，饱和磁化强度和磁电阻变化率分别提高到30mT和15％。最近，Porter等还进一步发展了含内校准的GMR微阵列。与此同时，国内一些科研单位，如中国科学院电工研究所、清华大学、电子科技大学等，也先后开展以上领域的研究，并取得了一定的进展。清华大学等利用三步光刻工艺制备了GMR传感器，采用交流检测的方式对200μg/mL的2μm免疫磁球进行了初步检测。结果显示：尽管不含磁球的溶液会造成信号的波动，但不影响传感器的最终稳定输出，附着磁球后产生了350μV的信号输出。