[发明专利]一种抗RNA病毒siRNA分子的设计方法

说明书

技术领域

本发明属于RNA干扰技术领域，特别涉及一种抗RNA病毒siRNA分子的设计方法。

背景技术

RNA类病毒种类很多，分布广泛，水生和陆生动物以及人类均有感染。如对水生养殖虾类造成严重威胁的桃拉病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)和对陆生动物包括人类危害巨大的流感病毒(Flu virus)、人甲型肝炎病毒(HAV)、艾滋病毒(HIV)，以及各种冠状病毒如严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等。由于RNA病毒在RNA的复制过程中，其错误修复机制的酶的活性很低，几乎是没有的，所以其变异很快；而疫苗是要根据病毒的固定基因或蛋白进行开发制作的，所以RNA病毒疫苗较难开发！

RNA干扰技术，作为一种以短双链RNA(siRNA)代替传统反义核酸的转录后基因沉默机制，自2002年被《Science》评为年度10大突破以来，已经被迅速而广泛地应用到了基因功能、基因表达调控机制等热门领域，并为疾病基因治疗、抗病毒感染开辟了新的途径。相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除，整个流程设计更简便，作用更迅速，效果更明显，成为研究人员公认的高效特异、经济便捷的研究工具，在细胞水平和动植物体内均表现出高效特异的抗病毒能力。由于RNA干扰技术是转录后基因沉默机制，直接靶标是病毒转录产生的mRNA，那么对于RNA病毒尤其是正链RNA病毒而言，RNA干扰技术就可直接降解病毒基因，因此RNAi技术对于RNA类病毒的防治而言无疑是一个上佳之选。许多研究结果也证实，RNA干扰技术抗病毒领域取得了预期的成果。

但是，由于抗病毒用siRNA仅仅是21个碱基对的短小序列，根据常规的小RNA设计原则，多数病毒基因组将产生成百上千个候选siRNA。尤其是像冠状病毒科成员那样的基因组巨大的RNA病毒，根据常规设计原则将需要花费大量的人力、物力，用来筛选在实际应用中能高效抗病毒的siRNA(由于目标RNA的空间结构等原因，导致许多理论上符合“有效”原则的siRNA在实际应用中无效或低效)。因此，如何有效缩小高效siRNA的筛选范围一直是RNA干扰技术研究人员探究的热点问题，也是关系到能否有效降低RNA干扰技术的研究与应用成本，使其最终能在生产实践中得到推广、应用的关键问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抗RNA病毒siRNA分子的设计方法，该方法设计的siRNA分子，将在保证获得高效抗病毒siRNA的前提下，大幅缩小RNA分子筛选范围，显著降低抗病毒研究和应用成本，有利于RNA干扰技术在抗RNA病毒领域的推广和应用。

本发明中一种抗RNA类病毒siRNA分子的设计方法，包括：

(1)在RNA病毒的基因组中选择序列保守的病毒酶的编码基因作为siRNA的靶标；

(2)利用siRNA设计软件生成抗RNA类病毒的小RNA分子；

(3)根据siRNA设计规则，筛选理论上高效的siRNA用于实验研究。

所述步骤(1)中的序列保守的RNA病毒酶为RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)。

所述步骤(3)中的小RNA分子的抗病毒应用形式为，把小RNA分子构建成含RNA聚合酶III启动子U6的表达质粒。

表1是shRNA在TGEV不同结构基因和RdRP基因上的靶向序列。其中，shP1和shP2靶向TGEV RdRP基因，而shS1、shS2、shM、shN1和shN2分别靶向TGEV的不同结构基因；shT靶向与TGEV基因没有同源性的一段任意序列，用作显示shRNA干扰特异性的对照。

表1

我们通过对RNA病毒——TGEV进行细胞水平的RNA干扰研究发现，在分别靶向病毒RdRP基因和结构蛋白基因的siRNA中，两个靶向RdRP的小RNA表现出远远高于其他siRNA的抗病毒效果。随后在小型猪体内水平进行的抗病毒应用研究，进一步证实了这两个siRNA分子抗病毒的高效性和特异性。

有益效果