[发明专利]一种沙拉沙星的荧光偏振免疫分析检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及沙拉沙星的一种荧光偏振免疫分析方法，属于荧光偏振免疫分析检测技术领域。

技术背景

沙拉沙星(Sarafloxacin，SAR)属于动物专用的氟喹诺酮类药物，药用其盐酸盐，具有广谱抗菌、活性强、毒副作用小等特点，主要用于治疗鸡、猪的敏感细菌及支原体感染所致的疾病。据报道，盐酸沙拉沙星的半衰期较长，在食品动物中的残留会引起耐药性，过量的药物残留也会直接危害动物及人体健康。我国规定动物性食品中兽药沙拉沙星的最高残留限量不超过80μg/kg。

目前，用于(氟)喹诺酮类药物检测的主要方法有四大类：微生物法、仪器分析法、化学发光分析法及免疫分析法。微生物法适用于检测高浓度的药物残留，主要用于大量样品的快速筛选；常用的仪器分析法有高效液相色谱法、液-质联用分析法、高效毛细管电泳法等；此类分析法虽然具有高效、灵敏、快速准确的特点，但是使用的仪器昂贵，而且样品前处理较繁琐，不适合大量样品的快速检测；免疫分析法主要包括酶联免疫吸附法、免疫亲和柱色谱分析法、免疫传感器分析法等。免疫分析法准确性好、灵敏度和特异性高、快速准确，可用于大量样品的快速检测，因此免疫分析法尤其是酶联免疫吸附分析法(ELISA)现已广泛应用于小分子农药以及兽药的快速筛选残留检测。但是ELISA法大多属于非均相的免疫分析法，由于在操作过程中需要分离结合的和未结合的抗原(抗体)或酶标记物，耗时较长，所以迫切需要发展一种更加简便快速的分析方法。

荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)则具备了这一特点，是一种快速、简便、高效、可靠的分析方法，而荧光偏振免疫分析法的关键是小分子荧光标记物的成功制备以及需要高特异性的抗体，当二者同时具备时，即可通过待测沙拉沙星和沙拉沙星荧光标记物同时竞争结合沙拉沙星抗体时偏振值的变化(竞争法)进行沙拉沙星的荧光偏振免疫分析，而国内尚未有关沙拉沙星荧光标记物的制备以及沙拉沙星荧光偏振免疫分析方法建立的报道。

发明内容

本发明的目的是解决传统分析方法操作复杂费时的问题，提供一种沙拉沙星荧光标记物的制备方法以及利用荧光标记物和高特异性的抗体建立的沙拉沙星荧光偏振免疫分析方法。

本发明提供的沙拉沙星的荧光偏振免疫分析方法，利用沙拉沙星作为半抗原偶联FITC荧光素合成荧光标记物，并以沙拉沙星标准品，沙拉沙星多克隆抗体为抗体，建立了沙拉沙星的荧光偏振免疫分析方法，步骤如下：

(1)沙拉沙星荧光标记物的制备：

a.称取3～4mgSAR溶于由100μL水、500μL甲醇、50μL三乙胺组成的混合溶剂中形成A液；

b.称取6mg异硫氰酸荧光素FITC溶于600μL甲醇中形成B液；

c.取200μLB液逐滴加入A液中，震荡，室温避光过夜；

d.次日，以CHCl₃∶MeOH＝2∶1(V/V)为展开剂，室温下对c步的反应液进行薄层层析，分离纯化，紫外投射仪下观察，选择Rf＝0.1的条带，用120μL甲醇萃取，得到沙拉沙星荧光标记物；

(2)沙拉沙星荧光标记物工作浓度的确定：

用2.5mmol/L、pH＝8.0的硼酸盐缓冲液倍比稀释得到不同浓度的沙拉沙星荧光标记物，检测荧光偏振光强度，以5倍于空白溶液的偏振光强度所对应的浓度作为沙拉沙星荧光标记物的工作浓度；即最终选取1/12800的稀释浓度，空白溶液选用2.5mmol/L、pH＝8.0的硼酸盐缓冲液；

(3)沙拉沙星多克隆抗体的工作浓度的确定：

在每个试管中依次加入500μL用2.5mmoL/L、pH＝8.0的硼酸盐缓冲液稀释的比例分别为1/100，1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200的沙拉沙星多克隆抗体(本实验室自制)，并依次加入500μL步骤(2)确定的工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，混匀后室温孵育5min，检测荧光偏振光强度，以最大偏振值70％对应的抗体浓度作为抗体的最佳工作浓度，即最终选取1/1600的稀释浓度；

(4)竞争

盐酸沙拉沙星用双蒸水分别稀释成浓度为1000，100，10，2.5，1，0.25，0.1，0.01μg/mL的系列溶液并分别加入7个试管中，另设一个双蒸水空白对照，40μL/管；每管加入480μL工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，最后分别加入480μL工作浓度的沙拉沙星多克隆抗体，混匀后室温孵育5min，检测其荧光偏振光强度；

(5)建立沙拉沙星的标准抑制率曲线