[发明专利]三疣梭子蟹PtCrustin-1基因及其编码蛋白和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹PtCrustin-1基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

Crustin是在甲壳动物体内发现的一种富含半胱氨酸残基的阳离子抗菌肽。它的分子量大小为7-14kDa，等电点在7.0-8.7之间，N端包含信号肽，C端包含WAP(whey acidic protein)结构域，该结构域是由8个Cys组成的四个二硫键核心(4-DSC)构成。根据在信号肽和WAP结构域之间的中间序列区结构，Crustin可分为I-III三种类型。I型Crustin主要存在于蟹、龙虾和螯虾中；II型和III型Crustin主要发现于对虾中。

Crustin最初被命名为carcinin，是从Carcinus maenas的颗粒血细胞中发现，而且对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用。目前已有70多条Crustin序列在不同的甲壳动物中报道，包括蟹、龙虾、对虾和螯虾等。研究表明这些天然纯化或者体外重组的Crustin蛋白都具有明显的抑制革兰氏阳性菌生长的作用，而且都是高水平的组成型表达，提示Crustin在甲壳动物固有免疫系统中发挥重要作用。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海产经济蟹类，由于其营养价值丰富、生长迅速等优点，已成为我国重要海水养殖品种。但随着养殖规模不断扩大以及集约化程度不断提高，由细菌、真菌等引起的各种疾病日趋严重，给梭子蟹养殖业造成巨大的经济损失。病害的不断爆发和病因的多样性迫切需要从三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病机制和开发新型的抗菌药物。

到目前为止，关于三疣梭子蟹Crustin的研究尚少。因此，识别、定性抗菌效应分子-Crustin对研究三疣梭子蟹的免疫防御机制和进行病害防治具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种三疣梭子蟹PtCrustin-1基因及其编码蛋白和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种三疣梭子蟹PtCrustin-1基因为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。

三疣梭子蟹PtCrustin-1基因编码蛋白为序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示。

三疣梭子蟹PtCrustin-1基因的应用：所述三疣梭子蟹PtCrustin-1基因编码蛋白的重组表达产物用于制备抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。

所述三疣梭子蟹PtCrustin-1基因编码蛋白的重组表达产物可用于制备革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抑菌药物。所述革兰氏阴性菌为铜绿假单胞菌，革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌。

本发明所具有的优点：本发明利用表达序列标签技术(EST)、RACE技术从三疣梭子蟹中克隆到PtCrustin-1基因cDNA全长序列，通过PCR技术扩增编码PtCrustin-1成熟肽的基因片段并将其克隆到pET32a(+)表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)-plysS实现体外重组表达。重组蛋白经TALON柱纯化和透析后，对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌具有显著的抑菌活性，最小抑菌浓度分别为1.50μM、24.03μM、24.03μM、48.06μM；而对革兰氏阴性菌溶藻弧菌、真菌毕赤酵母没有明显的抑制作用。

本发明基因及其重组蛋白主要在药物生产、免疫增强剂、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂生产中应用，另外还可以为进一步研究三疣梭子蟹免疫防御机制提供基础，并为三疣梭子蟹的病害防治和基因辅助选育提供参考。

附图说明

图1为本发明实例提供的纯化的三疣梭子蟹PtCrustin-1编码成熟肽的基因扩增产物电泳图(其中，M：DNA marker，1：成熟肽的基因扩增产物)。

图2为本发明实例提供的诱导和纯化的三疣梭子蟹PtCrustin-1重组蛋白电泳图(其中M：蛋白marker；1：未诱导菌体中表达的蛋白；2：IPTG诱导后表达的蛋白；3：纯化的重组蛋白)。

具体实施方式

下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。

本发明中的三疣梭子蟹PtCrustin-1的cDNA序列克隆包括下列步骤：

a)三疣梭子蟹总RNA的提取及mRNA的纯化；

b)三疣梭子蟹cDNA文库构建；