[发明专利]云南红梨ΔPyTTG1基因及其原核表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨色素调控和毛状体发生发育调控蛋白基因ΔPyTTG1及其原核表达载体，以及原核表达载体在制备ΔPyTTG1蛋白和特异性抗体中的应用。

背景技术

红色表皮是梨分子育种的重要性状指标。云南省因其独特的地理和气候条件而拥有较多的红皮梨种质资源，1986年以来先后已选育出早白蜜、美人酥、满天红和云红梨1号四个栽培品种。但生产中除云红梨1号外，其它3个品种都会因气候变化而导致着色较差甚至不着色，因此需要研究红梨果皮的着色机理。已有研究表明植物花青素的合成是由转录复合物MYB/bHLH/ WD40调控的。前人对MYB和bHLH研究较多，而对植物中的WD40蛋白研究较少。WD40蛋白含WD40基序（约40氨基酸的保守序列，以甘氨酸-组氨酸(GH)开始, 以色氨酸-天冬氨酸(WD)结尾）。WD40蛋白含1-10个串联的WD40基序，一般认为至少4个以上的WD40基序才能形成高级和有功能的结构。研究表明WD40蛋白是一个结构多样、功能各异的蛋白家族，通常它们具有两个共同特征：一是结构域折叠成β-螺旋桨结构，一是形成多蛋白可逆组装但不具任何催化活性的平台，它们主要是在真核生物的蛋白质-蛋白质复合物形成中起作用。许多研究表明WD40蛋白在蛋白质复合物形成过程中具有支架作用。在植物中，WD40蛋白的作用主要是作为植物特异性发育事件如开花、花发育、分生组织形成、花粉发育和配子形成关键调节因子。WD40蛋白主要通过其WD结构域与其它蛋白互作，参与植物体内众多代谢反应的调控。Morita等人在牵牛花中发现具有隐性基因ca（编码InWDR1蛋白）的突变体中，除CHS外，花青素合成途径的结构基因的表达都协同地减少。Wallker等人首次通过定位克隆和互补试验发现TTG1蛋白调控花青素的合成和毛状体分化。拟南芥TTG1蛋白含4个WD40基序，其ttg1突变体的特点是缺乏表皮毛、种皮透明、种子不经休眠就直接萌发、植株完全缺乏花青素、具有异常的根发育模式等突变表型，这表明TTG1的功能是多效的。棉花GhTTG1和GhTTG3具有拟南芥AtTTG1的类似功能：不仅能够恢复拟南芥ttg1突变体形成毛状体和花青素，而且还能互补紫罗兰ttg1突变体在花瓣产生紫色斑点。De等人在矮牵牛中首次发现WD40蛋白PhAN11，其定位于细胞质，能够连接信号转导与转录激活，能够调控PhAN2（MYB）的功能。玉米中PAC1与矮牵牛和拟南芥中花青素调控蛋白AN11、TTG1极为类似，且35S-PAC1能够互补ttgl突变体。Dressel等人发现WD基序中单个氨基酸的突变(W158R)就可抑制DFR基因的表达，进而导致白花表型，且MiTTG1的54.1%高GC含量是进化的信号。Matus等人在拟南芥中异位表达葡萄WDR1导致拟南芥地上部分和莲座叶中花青素的合成，并通过GFP融合蛋白技术证明WDR1定位于细胞质和细胞核。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTG1(WD40)和MYB蛋白（GL1, PAP1、PAP2、CPC、TRY）组合，形成MYB/bHLH/WD40复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形成的多功能的调控。Brueggemann等人通过互补试验证实了苹果MdTTG1具有类似拟南芥AtTTG1的功能。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTG1(WDR) 能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Bouyer通过克隆分析、异位表达和微注射试验提出了毛状体形成的捕获-耗尽机制：在高浓度的毛状体促进蛋白GL3细胞中，GL3通过结合毛状体形成蛋白TTG1来耗尽临近细胞中的TTG1，从而导致毛状体形成，而周围的细胞因TTG1的减少而不能形成毛状体。而Zhao等人通过离子轰击试验证明了TTG1，GL3，GL1和GL2并不在邻近细胞间转移，而R3-MYB， CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTG1复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。TTG1是多功效基因，Gonzalez等人还发现TTG1能够与MYB5和TT2（MYB）形成复合物控制外种皮的分化。