[发明专利]云南红梨ΔPybHLH基因及其原核表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨花青素生物合成及毛状体发生发育调控蛋白基因的特异性片段?PybHLH及其原核表达载体，和原核表达载体在制备?PybHLH蛋白和特异性抗体中的应用。

技术背景

红色果皮是梨分子育种的重要性状指标。云南省因其独特的地理和气候条件而拥有较多的红皮梨种质资源，1986年以来先后已选育出早白蜜、美人酥、满天红和云红梨1号四个栽培品种。但生产中除云红梨1号外，其它3个品种都会因气候变化而导致着色较差甚至不着色，因此需要研究红梨果皮的着色机理。已有研究表明植物花青素的合成是由转录复合物MYB/bHLH/ WD40调控的。前人对MYB研究较多，而对植物中的bHLH和WD40蛋白研究较少。在拟南芥中LDOX基因启动子直接包括EGL3和TT8在内的不同的MYB-BHLH-TTG1转录复合物的调控，egl3、tt8和egl3 tt8功能缺失突变体试验也表明了egl3和tt8是拟南芥幼苗花青素累积的必要条件。在拟南芥中JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白与WD-repeat/bHLH/MYB 转录复合物中的bHLH（Transparent Testa8， Glabra3 [GL3]和 Enhancer of Glabra3 [EGL3]）和R2R3 MYB 转录因子(MYB75和Glabra1)互作，抑制了JA调控的花青素的累积和毛状体的发生，而JA诱导的JAZ蛋白的降解能够解除这种抑制。在大丽花(Dahlia variabilis)中，bHLH转录因子DvIVS通过调控DvCHS1，DvF3H，DvDFR和DvANS的转录来参与其花青素的生物合成。在葡萄中，bHLH转录因子MYCA1可能通过调控ANR和UFGT基因的表达来调控其花青素的生物合成。在龙胆花（G. triflora）中，GtMYB3和GtbHLH参与花青素的生物合成。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTG1(WD40)和MYB蛋白（GL1， PAP1、PAP2、CPC、TRY）组合，形成MYB/bHLH/WD40复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形成的多功能的调控。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTG1(WDR) 能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Bouyer通过克隆分析、误表达和微注射试验提出了毛状体形成的捕获-耗尽机制：在高浓度的毛状体促进蛋白GL3细胞中，GL3通过结合毛状体形成蛋白TTG1来耗尽临近细胞中的TTG1，从而导致毛状体形成，而周围的细胞因TTG1的减少而不能形成毛状体。而Zhao等人通过离子轰击试验证明了TTG1，GL3，GL1和GL2并不在邻近细胞间转移，而R3-MYB，CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTG1复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。

在云南红梨着色机理研究方面，本实验室研究了光照对云南红梨着色的影响、构建了光诱导果皮差异表达基因的SSH文库，进行了着色相关基因的分离和表达分析。前期研究结果表明云南红梨果皮花青素的生物合成是由MYB/bHLH/WD40调控的。在前人研究基础上，针对云南红梨栽培品种早白蜜、满天红、美人酥着色不稳定、在国内外尚未见有关云南红梨果皮红色着色机理方面研究报道。在云南红梨着色机理研究中，还没有人克隆转录因子bHLH，研究中PybHLH蛋白无法进行特异性检测和分析。目前世界红梨极其稀少，世界市场缺口较大；此外，云南红梨外观和内在品质好，商品价值高，红梨将成为梨产业发展的新的增长点，红梨育种成为梨树育种的重要方向。但是，指导育种的红梨着色的科学理论匮乏，本发明的成果将为果树及花卉的分子育种奠定基础。本发明选择着色最好且稳定的‘云红梨1号’作为试验材料，开展云南红梨‘云红梨1号’PybHLH转录因子基因特异性片段的克隆、序列分析和原核表达、蛋白纯化和抗体制备的研究，制备的抗体可用于云南红梨PybHLH蛋白的纯化、定位检测、表达分析以及PybHLH所结合蛋白和DNA片段的高效分离。

 

发明内容

本发明的目的在于提供一个PybHLH基因的特异性片段?PybHLH，该基因是云南红梨花青素生物合成及毛状体发生发育调控蛋白基因的特异性片段，具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列或编码如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的蛋白质。