[发明专利]经由体细胞胚胎发生的质体遗传工程

说明书

本申请是申请日为2003年7月3日、发明名称为“经由体细胞胚胎发生的质体遗传工程”的中国专利申请03818695.0(国际申请号PCT/US2003/021157)的分案申请。

关于联邦政府资助的研究的声名

在此申请中报道的研究部分地受到NIH R 01 GM63879资金的资助。

发明领域

本发明领域涉及植物质体遗传工程。更具体的是，本发明涉及通过质体转化来转化非绿色植物细胞，以及随后通过体细胞胚胎发生来再生非绿色植物细胞。

背景技术

因为具有若干有吸引力的有利条件，包括高水平的转基因表达(Daniell等人，2002)、单一转化事件中的多基因改造(DeCosa等人，2001；Ruiz等人，2003；Daniell & Dhingra，2002)、经由母系遗传的转基因限制(Daniell2002)、基因沉默的缺乏(Lee等人，2003；DeCosa等人，2001)、位点特异的转基因整合导致的位置效应(Daniell等人，2002)和多重效应(Daniell等人，2001；Lee等人，2003)，因此质体对于遗传工程而言是理想的。叶绿体遗传工程最适合高表达疫苗抗原和生产有价值的治疗蛋白质。自从我们展示了用于各种生物医学用途的人弹性蛋白衍生聚合物的表达(Guda等人，2000)，我们已将这一方法拓展到表达霍乱、炭疽的疫苗抗原(Daniell等人，2001，Daniell 2003)、单克隆抗体(Daniell等，2001)和人的治疗蛋白质，包括人血清白蛋白(Fernandez等，2003)、爪蟾抗菌肽(DeGray等，2001)、干扰素(Daniell，2003)和胰岛素样生长因子(Daniell，2003)。一些别的实验室已经在转基因叶绿体中表达了人生长激素干扰素-GUS(Human Somatotropin Interferon-GUS)融合蛋白质来提高稳定性(Reddy等人，2003)并在转基因叶绿体中表达了破伤风疫苗抗原(Tregoning等人，2003)。毫无例外，所有这些治疗蛋白质都被表达于转基因烟草叶绿体中，符合各种环境团体针对用于植物来源药物的食品作物倡仪的零容许度(zero-tolerance)。

然而，迫切需要治疗性蛋白质和疫苗抗原的口服递送来大大降低它们的生产、纯化、储存和运输成本，并最小化与静脉给药相关的并发症。因为饮食中胡萝卜是优异的糖、维生素A、C和纤维的来源，胡萝卜(Daucus carota L.)成为全球范围内人和动物食用的最重要的蔬菜之一。胡萝卜是两年生植物，在两年内完成其生命周期。在第一年植物产生可食的肉质主根。如果将其留在地里，在经过一个寒冷的季节后，植物于第二年开花(Yan，W.& Hunt，L.A Reanalysis of Vernalization Data of Wheat and Carrot，Annals of Botany 84，615-619(1999))。另外，种植的胡萝卜作物的叶绿体基因组严格通过母系遗传传递(Vivek等人1999)。因此，胡萝卜在环境上是安全的，并且通过双重保护阻止了转基因经由花粉和种子的流动，从而符合对食品作物中的转基因流动提出的零容许度倡仪。胡萝卜体细胞胚是单细胞来源的，通过循环的胚胎发生扩增；这提供了一致的细胞培养物来源，这一点是生产治疗蛋白质的必要条件之一(均一单一来源)。使用生物反应器，胡萝卜细胞迅速分裂并产生大量的生物量。培养的胡萝卜细胞是可食的，并可以被直接用于递送精确剂量的疫苗抗原或生物药物。当经由可食胡萝卜进行给药时不需要烹饪，这将保持治疗蛋白质在食用过程中的结构完整性。在培养基中能长期生存的、包裹的胚可以作为人工种子用于低温储藏和有控制的萌发(Tessereau，H.，B.Florin，M.C.Meschine，C.Thierry和V.Petiard，1994)。因此，具有增加的医学或营养价值的转基因胡萝卜能够在改善人或动物的健康方面扮演至关重要的环节。