[发明专利]一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体为一种基于环媒恒温基因扩增法（LAMP）基本原理，具备速度快、特异性强等优点的基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒。

背景技术

黄曲霉毒素（Aflatoxin，简写AF）是一种真菌毒素，主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生，它影响机体的免疫系统、致突变、致畸、致癌，对动物体和人体健康造成严重威胁。我国最新的饲料卫生标准对霉菌和毒素都做了严格要求。目前检测黄曲霉毒素的方法有薄层层析法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）等。但是，这些检测霉菌的方法其处理方法均局限于传统的真菌培养法以及生物学的聚合酶链式反应法（PCR），前者操作十分麻烦，时间需要4～7天，后者对仪器以及反应条件比较高，检测成本也相应提升，难以做到较大规模推广。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒，利用环媒恒温基因扩增（LAMP）法检测黄曲霉毒素真菌，可应用于饲料、食品等的样品检测。

环媒恒温基因扩增（Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）是日本学者Notomi等于2000年发明的一种新的高效的恒温基因扩增技术。该方法在恒温条件（60 ℃～65 ℃）通过4条引物B3、F3、BIP和FIP识别目的基因的6个特异性区域，在Bst DNA聚合酶的催化作用下扩增目的基因片段，反应包括链置换反应和环介导循环扩增两个密切相关的环节。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒，基于Ver-1基因建立LAMP法快速检测黄曲霉素真菌，并应用于饲料、食品的检测；应用ELISA法检测样品中AFB1毒素含量，并比较分析ELISA和LAMP检测结果，其具体包括以下制备步骤：

1．制备PDA培养基：称取去皮洗净的马铃薯100 g，放入500 mL蒸馏水中，将水煮沸至100 ℃并保持30分钟，过滤，加入10 g琼脂粉，补足水至1000 mL，调pH值至7.0，分装后高压灭菌，4 ℃保温贮存备用；

2．培养菌种：将黄曲霉接种于马铃薯固体培养基（PDA）上，28 ℃培养； 

3．设置环媒恒温基因扩增（LAMP）引物；

4．提取真菌DNA模板；

5．将模板、引物、dNTP和缓冲液等反应试剂按比例配制加入PCR管，将反应体系至于63 ℃的温度条件下保温60 min，其后在80 ℃下热浴3分钟灭活BstDNA聚合酶，反应终止，产物于2.0%琼脂糖凝胶中电泳；

6．参考株DNA提取液作模板，采用25μL反应体系。分别改变反应温度、反应时间、Mg²⁺的浓度、dNTP的浓度、Betaine的浓度，分别进行LAMP反应，用琼脂糖凝胶电泳判断LAMP结果，以选择最好的扩增条件；

7．用LAMP 检测法扩增黄曲霉，凝胶电泳成像检查扩增产物，判断该试验的特异性；

8．以上制备的模板作10n倍比稀释。分别取各稀释度1 μL进行LAMP扩增。结合饲料中霉菌总数的测定方法(GB/T13092-2006)，以MPN法测定所挑取的菌液浓度；

9．按照上述方法建立黄曲霉素真菌检测试剂盒；

在本发明中，凝胶用溴化乙锭染色，用以方便紫外线透射观察。

在本发明中，所述黄曲霉素真菌检测试剂盒可用SYBR Green I判断法和凝胶电泳成像法判断样品检测结果。

有益效果：本发明比传统的PCR技术更快、更准确。同时，LAMP法采用4条引物识别6个特异位点，保证了该方法高度特异性，同时，本发明还具备以下优点：

1．本发明在检测结果的方法上，充分利用LAMP的特殊优势，运用了传统的凝胶成像检测的同时，还利用SYBR Green I 实施可视化检测。SYBR Green I实施可视化检测避免了实际操作中EB带来的污染，而且检测的速度节约了40分钟以上；

2．本发明检测饲料中毒素真菌稳定性高，可重复性好。用该方法检测了180饲料样品，阳性率与ELISA方法吻合度高；

3．本发明中LAMP法检测饲料中黄曲霉毒素真菌检测成本不高，每个样品只需要约3.0元。LAMP法所用到的Bst酶价格比传统的Taq酶要贵，但本实验中对该酶5倍稀释后，一方面试验结果稳定，另一方面成本明显降低，平均每个样品的Bst酶只需要0.30元；