[发明专利]一种重组菌株发酵生产还原性辅酶Q10的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种重组菌株发酵生产还原性辅酶Q10的方法。

背景技术

还原性辅酶Q10是一种有效的抗氧化剂，其用途十分广泛，发达国家除药品外已广泛用于食品添加、日化产品、保健品、化妆品等领域。它的药效众多，临床已证实具有消除疲劳、增强体力、抗衰老、免疫调节作用、抗肿瘤作用、缓节帕金森氏症、治疗和缓解神经性头痛以及降低阿霉素或他汀类药物副作用等之功效。

还原性辅酶Q10和氧化性辅酶Q10是人体细胞中的线粒体电子传导系统的构成因子，在氧化磷酸化反应中起到搬运电子的功能，参与ATP的生成。以往大多数人都把氧化性辅酶Q10和还原性辅酶Q10混为一谈，其实还原性辅酶Q10才是真正具有生物活性的抗氧化体。氧化性必需转换成还原性的CoQ10后才具有抗氧化能力。还原性辅酶Q10可以直接被人体利用，与氧化性辅酶Q10相比在人的新陈代谢中具有更高的生物利用率。

近年来对还原性辅酶Q10的研究逐渐增多，目前其制作方法大致如下：

通过在DMEM-1培养液中进行细胞培养，获得含有还原性辅酶Q10的细胞液^[1]，此方法生产的辅酶Q10成本较高，含量也相对较低。

采用化学合成法，但其合成过程烦杂、危险，生产成本高，而且可靠性不高-必须最大限度地降低产生或混入异构体^[2]。

使用天然生物酶转化法生产。有专利报道，利用生物还原酶将氧化性辅酶Q10还原成还原性辅酶Q10，但这种方法要求使用纯度大于99％的氧化性辅酶Q10^[3]。另有报道，将辅酶Q10先磷酸化，再通过生物还原酶还原磷酸化的氧化性辅酶Q10，从而得到还原性辅酶Q10^[4]。

在抗氧化条件下生产。采用氯化钙-镁-水(醇)还原体系，将氧化性辅酶Q10快速制备成还原性辅酶Q10^[5]。在还原过程中使用至少一种选自烃、脂肪酸酯、醚和腈的溶剂保护还原性辅酶Q10免受氧化作用^[6]。这些方法效率低，含有较多的氧化性辅酶Q10，用已知的方法分离，回收还原辅酶Q10的成本很高。

另外还有利用微生物发酵法生产还原性辅酶Q10的有关报道，筛选产还原性辅酶Q10微生物，得到含有70％以上摩尔含量的还原性菌株，然后利用化学诱变方法提高其产量。但是化学诱变法提高产量有限，且多次诱变才能达到一定效果，耗费大量时间和精力^[7]。

利用基因工程理论改变细胞内代谢调节机制也是获得高产菌种的一个重要方法。通过基因重组提高氧化性辅酶Q10产量的成功例子不在少数。Cheong等^[8]将聚十异戊二烯焦磷酸(DPS)基因和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因一起插入载体pGPRX11中，通过质粒转化入Agrobacterium tumefaciensBNQ-pGPRX11-(KCCM-10554)中表达，得到氧化性辅酶Q10的高产菌，通过发酵工艺优化后产率达到6.69mg/g，工业化生产前景较好。

如上所述，目前尚无通过基因重组得到还原性辅酶Q10高产菌株的例子，更无利用重组还原性菌株进行工业规模发酵还原性辅酶Q10的报道。如果筛选到还原性辅酶Q10菌株，采用基因重组技术提高其生产能力，无疑对生产还原性辅酶Q10是非常有利的。

本发明利用分子生物学技术找到还原性辅酶Q10生产菌株的关键酶基因，通过重组DNA技术筛选带有目标基因的细胞，将目的基因引入生产菌株(如酵母菌等)，增强合成目的产物的能力，构建还原性辅酶Q10发酵重组菌株。利用重组菌株发酵生产还原性辅酶Q10，在从发酵物中回收还原性辅酶Q10，从而安全、高效地获得工业规模生产还原性性辅酶Q10的方法。

本发明利用高比例还原性菌株(还原性辅酶Q10占70％(摩尔含量)以上)，如Rhodotorula glutinis IFO1125、Saitoella complicate IFO10748扩增生产还原性辅酶Q10的关键基因如2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌合成酶基因、聚十异戊二烯焦磷酸(DPS)基因、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因，通过将带有目的基因的质粒转化至突变株中，随着细胞中合成酶基因拷贝数的增加，可积累较大量的产物。即找出辅酶Q10合成过程中的关键酶基因，通过其强化表达就有可能提高产物的产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组菌株发酵生产还原性辅酶Q10的方法，提高发酵生产还原性辅酶Q10的产量。