[发明专利]采用复合EST-SSR标记进行大白菜品种鉴定的方法

权利要求书

1.用于大白菜品种鉴定的EST-SSR引物, 其特征在于，包括Ⅰ套或Ⅱ套EST-SSR复合引物，其中的Ⅰ套EST-SSR复合引物包括:

BC1上游引物序列：5’- TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3’，BC1下游引物序列： 5’- CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3’；BC19上游引物序列：5’- TTGAAACTTGGTTGACGACG -3’，BC19下游引物序列： 5’- TTCTTCTTTGCGGCTGATTT -3’；BC26上游引物序列：5’- ATAACAACAACCTGCCCGAG -3’，BC26下游引物序列： 5’- GAAGCACAAGAACAGGGCTC -3’；

Ⅱ套EST-SSR复合引物，包括BC1上游引物序列：5’- TTTGTCCCTATTGCTCAGGG -3’，BC1下游引物序列： 5’- CCGAGAACGTCTTCTCCTTG -3’；BC9上游引物序列：5’- ACCTTCCGTCTCTGGGTCTT -3’，BC9下游引物序列： 5’- TTTTGAACGAGGTGGAGGAC -3’；BC10上游引物序列：5’- GAATCCTTTGGAAACGACGA -3’，BC10下游引物序列： 5’- GGGGACACAATTCTCCTGAA -3’；BC16上游引物序列：5’- CTTGCAAATGACCTGCTTGA -3’，BC16下游引物序列： 5’- GGGAGTTGGAGATGAGGTGA -3’；BC27上游引物序列：5’- ATCCAAAAGGAAGAATCCCG -3’，BC27下游引物序列： 5’- AAACGAGAATTTTCCTGCGA -3’  。

2.一种采用复合EST-SSR标记进行大白菜品种鉴定的方法，其特征在于按如下步骤的步骤进行：

（1）采用权利要求1所述的复合EST-SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq? Master Mixes 5 μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种大白菜杂交种基因组DNA模板，浓度50 ng/μL，1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为94℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 1 min，53.5℃ 45 sec，72℃ 45 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；

（2）对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE 3 mL，40% PAG 6 mL，TMED 30 μL，10% 过流酰胺 300 μL；设定电压 250 V，电泳 1 h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；

（3）通过分析EST-SSR结果，比较12份大白菜品种间多态性位点的差异，确定2套复合引物的多态率及多态信息量；在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，构建12份大白菜品种的SSR分析谱带数据，通过数据分析复合引物是否可对12份大白菜品种进行完全的区分，同时构建12份大白菜品种的指纹图谱；

其中所述的上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，指的是Ⅰ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物0.25μL、BC1下游引物0.25μL，BC19上游引物0.25μL、BC19下游引物0.25μL，BC26上游引物0.25μL、BC26下游引物0.25μL，或Ⅱ套EST-SSR复合引物中BC1上游引物0.25μL、BC1下游引物0.25μL，BC9上游引物0.25μL、BC9下游引物0.25μL，BC10上游引物0.25μL、BC10下游引物0.25μL，BC16上游引物0.25μL、BC16下游引物0.25μL，BC27上游引物0.25μL、BC27下游引物0.25μL。