[发明专利]小分子诱导猪精原干细胞转变为胚胎干细胞样细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪精原干细胞向多能性干细胞的转变及其用途，属于生物与新医药技术领域。

背景技术

精原干细胞是雄性体内唯一可以将遗传物质传递给后代的成体干细胞，在睾丸生精小管的微环境内具有自我更新和单向分化为雄性配子的能力。但在体内或体外其他的特定条件下，精原干细胞表现出更广泛的分化潜能和去分化能力，从而转变为其他类型的细胞。Liz Simona等研究表明将小鼠精原干细胞移植到体内的前列腺组织、皮肤组织及子宫组织，精原干细胞会失去自身的特性，分别转化为前列腺、皮肤和子宫上皮细胞；在体外的特定条件下，已被多个研究团队证实，小鼠精原干细胞在体外培养过程中通过自发去分化作用转变为多能性生殖干细胞，从而具有和胚胎干细胞相似的分化潜能，可形成具有生殖系转移的嵌合体小鼠后代。目前条件下，若能将此技术成功应用于大型家畜动物从而获得多能性生殖干细胞，成为胚胎干细胞的替代细胞，对当前仍无体外长期培养的胚胎干细胞的家畜的基因改造和育种具有重要意义。

睾丸内的支持细胞(Sertoli cells)可分泌生长因子GDNF和bFGF来调节精原干细胞的增殖和分化。GDNF被证实是维持精原干细胞自我更新所必需的细胞因子，GDNF通过src激酶激活PI3K/Akt信号通路并上调N-myc的表达，通过激活Ras/Erkl/2信号通路促进c-Fog的表达，从而促进小鼠精原干细胞的增殖和自我更新。碱性成纤维细胞生长因子(basic-Fibroblast Growgh Factor，bFGF)被证实可以促进多种细胞的增殖，睾丸内的支持细胞也可通过旁分泌的方式分泌bFGF作用于精原干细胞。LIF可以激活Jak/Stat3信号通路来维持小鼠ES细胞的自我更新，而Jak/Stat信号通路对精原干细胞的自我更新也具有重要作用，Jak或Stat92E的基因突变会导致精原干细胞的丧失。因此，在体外培养精原干细胞或将其转变为生殖系多能性干细胞的过程中，一般都使用用GDNF、bFGF和LIF。

在生长因子存在的情况下，猪的精原干细胞多能性相关基因表达量难以维持，细胞无法实现向生殖系多能性干细胞的转变。而oct4、nanog和klf4表达量的维持对干细胞自我更新和分化的细胞向多能性干细胞的转变具有重要意义。研究发现在小鼠ES细胞内，Vitamin A可以促进nanog的表达，而过表达nanog可促进小鼠ES细胞的自我更新即使在缺乏LIF激活LIF/stat3的情况下。Forskolin是一种双萜类化合物，它可以激活腺苷酸环化酶的催化活性，从而通过蛋白激酶A信号通路促进klf4的表达。De Felici证实forskolin能缓解PGC的自然死亡，使细胞存活时间延长。Shamblott等在培养液中添加10μmol/L的forskolin，从人胎儿中分离克隆出5个PGC多能干细胞系。可见Forskolin对促进生殖系细胞的存活和干细胞的建系具有重要作用。本研究分别向培养液内加入终浓度为1μM Vitamin A和10μMforskolin，real-time PCR检测显示可以明显促进猪SSCs nanog和klf4的表达。

精原干细胞向多能性生殖干细胞的转变是细胞重编程的一个过程，涉及到细胞基因组表观遗传改变。表观遗传的改变表现为组蛋白乙酰化水平和DNA甲基化水平的变化。一般情况下，组蛋白乙酰化水平高而DNA甲基化水平低将有利于基因的表达。目前有许多小分子化合物可以调节细胞组蛋白的乙酰化和DNA甲基化。研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA(trichostatin A)和DNA甲基化酶抑制剂AZA(5-aza-2’-deoxycytidine)的联合使用，可以降低组蛋白去乙酰化酶HDAC2和DNA甲基化酶DNMT1和DNMT3b的转录，oct4和sox2的表达量显著升高而DNA的甲基化水平显著下降。Oct4启动子区域DNA的去甲基化会促进Oct4基因的表达，而启动子区域DNA高度甲基化会使该基因沉默。同样在进行猪SSCs向生殖系多能性细胞诱导之前，我们已验证AZA和TSA可以促进猪精原干细胞oct4的表达。

附图说明

图1为猪精原干细胞的碱性磷酸酶染色(A)、Oct4免疫荧光(B)和原代形成的精原干细胞克隆(C)。

图2为单独使用小分子对猪精原干细胞细胞形态(A)和分子表达(B)的影响。

图3为在小分子作用下，猪精原干细胞形成胚胎干细胞样克隆团(A)、Oct4免疫荧光(B)和多能性基因(C)的表达情况。

具体实施方式