[发明专利]一种视网膜感光前体细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及视网膜感光前体细胞的分离培养方法。

背景技术

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，简称RP)是遗传性盲目最常见的病因之一。由于RP患者视力持续性下降的原因是感光细胞的变性和凋亡，而感光细胞不能再生，移植健康的视网膜组织或者感光细胞，已经成为目前最具前景的治疗策略。理想的供体细胞应当具有一定的可塑性，即处于由干细胞向成熟细胞发育的关键期，此时其正逐渐与上一级神经元发生整合，意味着这一时期的细胞具备与新生的、成年的、甚至病变的宿主视网膜发生突触联系的功能，早于或者晚于这一时期供体细胞均不能与宿主细胞发生融合。研究表明，处于特定时期的小鼠的视网膜感光前体细胞(Photoreceptor progenitor cell，PPC)可以与病变的视网膜建立突触联系，有效改善宿主视功能，这一开创性基础研究为视网膜移植临床试验指引了方向。根据这一研究成果，若能在人胚胎发育过程中寻找到具有该特性的理想的PPC细胞，就有可能对临床视网膜移植带来推动作用。

目前关于人胚胎视网膜感光细胞发育的生物学特性研究较少，如何分离获得胚胎感光细胞也仅仅在动物实验中开展。因此，研究人胚胎视网膜感光细胞发育变化，分离、纯化视网膜感光前体细胞，显得尤为重要。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供一种视网膜感光前体细胞的分离培养方法，能够从视网膜中分离感光前体细胞，尤其能从人胚胎视网膜中分离，且分离效率高，获得的感光前体细胞纯度高。

本发明提供了一种视网膜感光前体细胞的分离培养方法，包括如下步骤：

a.提供视网膜；

b.从步骤a中所述视网膜中分离出神经上皮组织；

c.消化分离步骤b中的神经上皮组织并制成细胞悬液；

d.将步骤c中的细胞悬液采用差速贴壁分离出视网膜感光前体细胞；

e.低氧培养步骤d中视网膜感光前体细胞。

该方法可以对不同物种、不同阶段的视网膜进行分离而得到感光前体细胞。

优选的，步骤a中所述视网膜为人胚胎视网膜。

优选的，所述人胚胎视网膜为12-16周的胚胎的视网膜。

视蛋白(Opsin)是感光细胞的标记物，成熟感光细胞(主要是视杆细胞)的典型特征是生色团块即Opsin的形成，表明该细胞具有光电转换的功能。通过收集不同胚龄的人胚胎视网膜，进行常规固定，冰冻包埋切片，做Opsin免疫荧光鉴定，然后对Opsin表达变化确定PPC细胞来源的最佳胚胎周龄为12-16周。如图1A-图1F所示，图1A-图1F分别为9周、12周、16周、20周、26周和32周的Opsin免疫荧光鉴定图，胚胎9周、12周时视网膜发育不成熟，大致可分为视网膜色素上皮细胞(Retinal Pigment Epithelium，简称RPE)层、外成神经细胞层(Outer neuroblast layer，简称ONBL)、内成神经细胞层(Innerneuroblast layer，简称INBL)，Opsin在该期视网膜中表达阴性；胚胎16周时视网膜各层细胞迅速分化，层次较前期鲜明和丰富，显微镜下可见RPE层、外核层(outer neuclear layer，简称ONL)、外丛状层(outer plexiform layer，简称OPL)、内核层(inner neulclear layer，简称INL)、内丛状层(innerplexiform layer，简称IPL)及神经节细胞层(ganglion cell layer，简称GCL)，首次可见少量细胞的Opsin染色阳性，即在第16周左右ONL层开始表达Opsin；随着周龄的增加，阳性细胞比例增多，20周时大部分ONL层细胞染色阳性，但着色程度较轻；而到26周、32周时，视网膜发育接近成熟，各层细胞排列更为紧密和有序，接近出生时的视网膜，Opsin在ONL和外节层(outer segment，简称OS)呈强阳性表达。Opsin在人胚胎第16周左右的视网膜ONL层开始表达，由此表明PPC细胞来源的最佳胚胎周龄为12-16周。

优选的，步骤b中所述神经上皮组织分离出后剪碎并用无钙镁液清洗。剪碎并用无钙镁液清洗有利于之后的组织消化。