[发明专利]一种基因合成方法、基因芯片及试剂盒

权利要求书

1.一种基因合成方法，其特征在于，在一张基因芯片上采用恒温刻痕和链位移扩增及聚合酶拼接反应进行寡核苷酸扩增以及基因组装，所述基因芯片通过将寡核苷酸固定在固相载体表面形成，寡核苷酸的3’端具有长度为15-150个碱基的接头序列且通过该接头序列中的刻痕内切酶识别位点锚定在芯片表面。

2.权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于，所合成基因的长度大于或等于200个碱基对。

3.权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于，还包含并采用错配特异性内切酶进行基因合成错误修复步骤。

4.权利要求3所述的基因合成方法，其特征在于，寡核苷酸扩增以及组装、基因合成错误修复三种反应在同一体系中先后连续进行或分步进行。

5.权利要求3所述的基因合成方法，其特征在于，基因合成错误修复反应在芯片上或芯片外单独进行。

6.权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于，所述基因芯片可以划分成一个或多个区域，寡核苷酸扩增以及基因组装在一个或多个区域同时进行。

7.权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于，所述恒温刻痕和链位移扩增及聚合酶拼接反应是采用一条通用引物与寡核苷酸3’端的接头杂交，在链移位聚合酶延伸并位移寡核苷酸链的同时，刻痕内切酶将通用引物从刚刚扩增出的寡核苷酸链上裂解下来，使通用引物的3’端重新游离，继续开始新的延伸反应。

8.权利要求3所述的基因合成方法，其特征在于，所述基因合成错误修复步骤为：通过热变性，让合成的基因重新退火，使错配位点暴露，错配位点被错配特异性核酸内切酶和3’→5’核酸外切酶活性识别并切除，所得的基因片段经交叠延伸PCR反应组装成完整基因。

9.一种基因芯片，通过将寡核苷酸探针固定在固相载体表面形成，其特征在于，寡核苷酸的3’端具有长度为15-150个碱基的接头序列且通过该接头序列中的刻痕内切酶识别位点锚定在芯片表面。

10.根据权利要求9所述的基因芯片，其特征在于，采用物理区隔的办法，将微阵列分为子阵列，每一个子阵列中包含合成总长大于0.2kb的寡核苷酸序列。

11.根据权利要求9或10所述的基因芯片，其特征在于，所述固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃片、硅片和塑料片。

12.一种基因合成的试剂盒，包含权利要求9-11任一项所述基因芯片、刻痕内切酶、链位移DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶以及错配特异性内切酶。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，还包含dNTP、B SA、Thermopol II缓冲液和寡核苷酸引物，所述Thermopol II缓冲液由20mM Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100组成，其在25℃的pH为8.8。