[发明专利]一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及微生物培养基和微生物发酵工艺；更具体的，本发明涉及一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法。

背景技术

近年来随着海洋药物的蓬勃发展，海藻多糖的研究日益受到重视，褐藻胶便是其中之一。褐藻胶又称褐藻酸钠，是从海带、马尾藻、巨藻中提取的天然高分子多糖聚合物，主要由两种糖醛酸单体聚合而成。褐藻胶具有广泛的应用价值，褐藻胶降解物具有很强的生物活性，以酶法降解褐藻胶为代表的生物降解取代传统的化学降解已成为趋势。褐藻胶裂解酶通过β-消去机制催化褐藻胶的降解在非还原端C4，5间形成不饱和双键，根据作用底物的不同可分为甘露糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.3)和古罗糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.11)。褐藻胶裂解酶可降解藻类细胞壁制备原生质体，用于藻类基础研究，也可用于研究Fucus细胞壁的发育，甚至作为解聚酶系统的一部分用来研究固氮菌的动力学。另外，褐藻胶裂解酶本身具有一定的药用价值，褐藻胶裂解酶能降解绿脓杆菌的细胞膜，恢复病原菌对抗生素的敏感性，用于辅助治疗绿脓杆菌引起的慢性感染，用其治疗肺部囊性纤维化一直是研究褐藻胶裂解酶的重要目标之一。因此褐藻胶裂解酶的研究生产有着深远的理论意义和应用价值。

近年来，随着褐藻胶裂解酶越来越多的应用于医药、食品、化工、农业、分子生物学、海洋生物学等领域，褐藻胶裂解酶日益成为海洋生物资源研究开发的竞争热点。目前国内外对褐藻胶低聚糖的研究工作主要集中在：1、褐藻胶酵解工艺的研究；2、特定褐藻胶低聚糖分子片段的提取和纯化；3、褐藻胶低聚糖的生理活性的开发和应用等方面。迄今为止，国内外市场均未见有褐藻胶裂解酶制剂的产品，也没有生产性的酶解褐藻胶产物的产品。

中国海洋大学从马尾藻表面分离得到一株产生高效胞外褐藻胶裂解酶的海洋弧菌Vibrio sp.QY102，其产生的褐藻胶裂解酶活性高、pH稳定范围广，甘露糖醛酸活性高于古罗糖醛酸活性，具有重要的开发应用价值。然而原始菌株在现有培养条件下的产酶量较低，且国内外鲜有关于原始菌株产褐藻胶裂解酶的发酵研究的报告。建立褐藻胶裂解酶的发酵工艺对于大规模生产褐藻胶裂解酶并促进其在工农医等领域的应用十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法。

在本发明的第一方面，提供一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法，该方法包括：

将海洋弧菌接种到以淀粉为碳源的培养基中培养，待海洋弧菌生长到对数生长期末期时，每1-6小时添加褐藻胶0.2-6g/L，诱导海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶，至发酵结束。

在一个优选例中，所述的海洋弧菌是能以褐藻胶为碳源，在褐藻胶诱导的情况下产生褐藻胶裂解酶的菌。

在另一优选例中，所述的海洋弧菌选自：海洋弧菌Vibrio sp.QY102，海洋弧菌Vibrio sp.QY101，海洋弧菌Vibrio sp.QY103。

在另一优选例中，每2-5小时添加褐藻胶0.3-4g/L，诱导海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶。

在另一优选例中，每3-4小时添加褐藻胶0.5-3g/L(较佳地，为1g/L)。

在另一优选例中，所述的以淀粉为碳源的培养基含有：可溶性淀粉3-7g/L，蛋白胨2-6g/L，酵母提取物1-6g/L，磷酸二氢钾1-3g/L，七水硫酸镁0.06-0.20g/L，氯化钠20-50g/L，混合于水(较佳地，为去离子水)中。

在另一优选例中，所述的以淀粉为碳源的培养基含有：可溶性淀粉4-6g/L，蛋白胨3-5.5g/L，酵母提取物1.5-4g/L，磷酸二氢钾1.5-2.5g/L，七水硫酸镁0.08-0.15g/L，氯化钠30-50g/L，混合于水中。

在另一优选例中，所述的以淀粉为碳源的培养基含有：可溶性淀粉4.5-5.5g/L，蛋白胨4-5g/L，酵母提取物1.8-3g/L，磷酸二氢钾1.5-2g/L，七水硫酸镁0.08-0.12g/L，氯化钠40-45/L，混合于水中。

在另一优选例中，先将可溶性淀粉进行糊化处理，再与其它组分混合。

在另一优选例中，所述的海洋弧菌生长到对数生长期末期为：菌体生长到OD₆₀₀值3.5-4.5(较佳地为4.0)的时期。

在另一优选例中，初始培养时，培养基的pH值是5±1(较佳地5±0.5；较佳地5±0.2)。

在另一优选例中，初始培养之后的整个培养过程不再调节pH值。