[发明专利]表达hsa-miR-21＊的重组腺相关病毒的制备方法及其在高血压病治疗中的用途

权利要求书

1.一种用于高血压和/或由高血压导致的各种并发症的基因治疗的重组腺相关病毒，其特征在于：该载体系统包括包装质粒pXX9，辅助质粒phelper，真核表达载体pAAV-D(+)，并在真核表达载体pAAV-D(+)内分别插入了人类hsa-miR-21^＊或anti-hsa-miR-21^＊表达序列。

2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒和腺病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成。

3.如权利要求1所述的重组腺相关病毒为分别表达人类hsa-miR-21^＊或anti-hsa-miR-21^＊的重组腺相关病毒，其特征在于：

1)pXX9：为包装质粒，含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列；

2)phelper：为辅助质粒，删除了腺病毒的致病基因序列，保留了感染性复制所需序列，它们表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激AAV基因的转录和翻译，保证AAV的产量；

3)pAAV-D(+)：真核表达载体，所用的是CMV启动子，有较强的表达效率，其含有多克隆位点，可以连接不同的目的基因；本发明pAAV-D(+)分别连接hsa-miR-21^＊和anti-hsa-miR-21^＊表达序列(pAAV-D(+)-miR-21^＊和pAAV-D(+)-anti-miR-21^＊)；该载体含有rAAV转基因表达所必须的末端重复序列(ITRs)，负责病毒的复制和病毒外壳的包被并携带目的基因。

4.如权利要求1所述的重组腺相关病毒是分别表达hsa-miR-21^＊和anti-hsa-miR-21^＊的重组腺相关病毒rAAV-miR-21^＊和rAAV-anti-miR-21^＊。

5.如权利要求1所述的重组腺相关病毒为分别插入重组腺相关病毒表达载体的人类hsa-miR-21^＊和反义anti-hsa-miR-21^＊表达序列，其特征在于：该序列由人工设计、化学方法合成。

6.该发明为一种药物制剂组合物，其特征在于：它包括有效量的权利要求1所述的分别表达人类hsa-miR-21^＊和anti-hsa-miR-21^＊的两种重组腺相关病毒和药学上所接受的载体或赋形剂。

7.如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于：该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒和腺病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成。

8.如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于：该重组腺相关病毒是分别表达人类hsa-miR-21^＊和anti-hsa-miR-21^＊的重组腺相关病毒rAAV-miR-21^＊和rAAV-anti-miR-21^＊。

9.一种制备分别表达人类人类hsa-miR-21^＊和anti-hsa-miR-21^＊的重组腺相关病毒的方法，其特征在于：

1)提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列——pXX9质粒，和刺激腺相关病毒复制和转录所必需的序列——phelper质粒；

2)提供含腺相关病毒基因组的真核表达载体pAAV-D(+)，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并分别插入hsa-miR-21^＊和anti-hsa-miR-21^＊表达序列，分别形成重组质粒pAAV-D(+)-miR-21^＊和pAAV-D(+)-anti-miR-21^＊；

3)将步骤2)中获得的pAAV-D(+)-miR-21^＊和pAAV-D(+)-anti-miR-21^＊分别与pXX9、phelper质粒共转染293细胞，适时回收，并纯化、检测其病毒滴度；

4)将步骤3)中回收纯化的病毒经尾静脉注射入高血压动物体内，检测其生物学活性。

10.根据权利要求书9所述的方法，其特征在于：在步骤3)中共转染的方法是钙磷DNA共沉淀转染法；真核表达载体pAAV-D(+)所含启动子为CMV启动子；用乙醇纯化，用real-timePCR法检测滴度。