[发明专利]一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法

权利要求书

1.一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)选择6种糖基配体，与乳清蛋白按照一定比例混合，溶解，配制成一定浓度的水溶液，备用；

(2)将溶解好的乳清蛋白和糖溶液分别调至不同的pH，备用；

(3)将调整好pH的乳清蛋白和糖溶液放入具塞试管中，至于烘箱中加热；

(4)控制乳清蛋白与糖反应的温度与时间，制得乳清蛋白糖基化复合物，即最终产品；

(5)对不同pH条件下的，不同浓度的6种乳清蛋白糖基化复合物进行褐变程度分析；

(6)对不同pH条件下的，不同浓度的6种乳清蛋白糖基化复合物进行游离氨基浓度浓度测定；

(7)对不同pH条件下的，不同浓度的6种乳清蛋白糖基化复合物进行还原能力及体外抗氧化能力测定，筛选出具有较强抗氧化能力的糖基化复合物及最佳反应条件。

2.根据权利要求1所述一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法，其特征在于步骤(1)所述的选择6种糖基配体，分别为木糖(X)、葡萄糖(G)、果糖(F)、乳糖(L)、蔗糖(S)、麦芽糖(M)，分别按2∶1比例溶解，配制成60mg/ml的水溶液。

3.根据权利要求1所述所述一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性法，其特征在于步骤(2)所述的采用氢氧化钠和盐酸将每一种种乳清蛋白和糖溶液分别调pH(3、4、5、6、7、8、9)，然后放入具塞试管中。

4.根据权利要求1所述所述一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法，其特征在于步骤(3)和(4)所述的将不同pH条件下的6种乳清蛋白和糖溶液，置于烘箱中，控制在50℃条件下进行反应，反应7d，即得乳清蛋白糖基化复合物。

5.根据权利要求1所述所述一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法，其特征在于步骤(5)、(6)、(7)所述的对不同pH条件下的6种乳清蛋白 糖基化复合物进行褐变程度分析，游离氨基含量测定以及还原能力、DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力及抗脂质过氧化能力进行比较，筛选出抗氧化能力较强的乳清蛋白糖基化复合物，及最佳制备了条件，所述的试验方案：

①褐变程度分析

将待测样品采用蒸馏水进行稀释成质量浓度为10mg/ml的溶液，测定其在420nm条件下的吸光值；同时将待测样品采用蒸馏水进行稀释成浓度为5mg/ml的溶液，随时间变化，测定其在294nm条件下的吸光值。

②游离氨基酸含量的测定

采用OPA方法100mL邻苯二甲醛(OPA)试剂含：50mL浓度为0.1mol/L硼酸盐缓冲液，5mL质量分数为20％的SDS溶液，80mg OPA(溶于2mL甲醇)，200μLβ-巯基乙醇。取样品液100μL(浓度为5mg/ml)和3mLOPA试剂混合，室温暗处反应5min后，340nm处测其吸光值。以L-亮氨酸为标准物，按上述方法绘制出L-亮氨酸浓度(0.25～20mmol/l)与吸光值之间的标准曲线回归方程，根据测定样品的吸光值，利用标准曲线方程，计算得出样品中的游离氨基酸浓度。

③还原能力测定

取样品0.5mL(浓度为30mg/ml)的样品，加入2.5mL磷酸盐缓冲液(浓度为0.2mol/L，pH值为6.6)和2.5mL的1％铁氰化钾溶液，混合均匀。再将混合物在50℃下水浴保持20min后急速冷却，加入2.5mL的10％的三氯乙酸溶液，然后将混合物在5500r/min下离心10min。取2.5mL上层清液，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL的0.1％的氯化铁溶液，混合均匀，放置10min后，在700nm处测定其吸光值。

④DPPH自由基清除能力的测定

将样品稀释成30mg/mL的浓度，取样液1.0mL及4.0mL浓度为0.12mmol/L的DPPH乙醇溶液(体积分数为95％)，混匀，室温下避光反应30min，如有沉淀可在5500r/min条件下离心5min。用体积分数为95％乙醇溶液作参比，于517nm测定吸光值。根据下式计算每种样品液对DPPH自由基的清除率：

清除率＝(1-Ai-Aj/Ac)×100％

式中：Ai：为加样品液后DPPH溶液的吸光值；

Aj：为样品液的吸光值；

Ac：为未加样品液时DPPH溶液的吸光值。

⑤清除·OH自由基的确定 

利用Fenton反应产生羟基自由基(·OH)，水杨酸能够有效捕捉·OH，生成有色物质2，3-二羟基苯甲酸，其在510nm处有强吸收。

向试管中加入1.00mL蒸馏水、FeSO₄溶液1.00mL(浓度为10mmol/l)、水杨酸-乙醇1.00mL(浓度为10mmol/l)、最后加H₂O₂(0.03％)1.00mL启动反应，振荡混合，在波长510nm处测定其吸光度值。向试管中加入一系列不同糖基化改性条件的溶液1.00mL(浓度为30mg/ml)，FeSO₄溶液1.00mL，水杨酸-乙醇1.00mL，最后加H₂O₂(0.03％)1.00mL启动反应，振荡混合，水浴37℃，保温30min，5500r/min离心7min，在波长510nm下测量吸光度值。

SA＝[1-(A_S-A₀/A_C-A₀)]×100％

式中：A_C：不加清除剂时吸光度为；

A_S：将样品的吸光度；

A₀：空白管吸光度，以水代替样品。

⑥抗脂质过氧化能力测定

脂质体PBS分散体系的制备(LLS)：30mg卵磷脂溶于30mlL PBS(10mmol/l，pH＝7.4)溶液中，与超声波中处理数分钟得到均质的脂质体分散液，冰浴保存备用。三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCL)混合液，15gTCA，0.375gTBA，2.1mlHCL依次溶于100ml水中。

测定步骤：与样品管中依次加入1mlLLS，1ml400μm/硫酸亚铁溶液和1ml样品，混匀。避光于37℃水浴60min，再加入2ml的TCA-TBA-HCL混合液，100℃水浴15min，迅速冷却，以5500r/min离心10min，取上清液532nm处测得吸光度。

抑制率(％)＝[(As-Ac)/Ac]×100％

式中：As：加样品管吸光度；

Ac：空白管吸光度，以水代替样液。