[发明专利]一种简便的农杆菌介导甘蔗转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物转基因方法，具体涉及一种简便的农杆菌介导甘蔗转基因方法，属生物技术领域。

背景技术

基因工程是指按照人们的愿望，通过严密的实验设计，利用体外DNA重组和转基因等技术，在较短的时间内创造出更符合人们需求的目标生物类型。随着现代分子生物学理论的发展和研究技术的进步，利用基因工程技术开展生物品种的定向改良和目标性状育种成为可能，其中利用转基因技术改良作物品种具有独特的优势。其中，狭义的转基因技术主要有两种，一是基因枪介导方法，二是农杆菌介导方法。基因枪介导的转基因技术在甘蔗上已经有较多成功的应用实例，但是，该技术具有运行费用高、目的基因插入位点不确定、获得的转基因株系几乎都是多拷贝等缺点。与基因枪介导的转基因技术相比，农杆菌介导的转基因技术具有以下几个优点：1、无需昂贵设备，所采用试剂皆为常规试剂，运行费用低；2、目的基因插入位点明确；3、获得单拷贝转基因后代频率高，性状遗传稳定性高，同时，由于该途径获得的转基因后代为单拷贝或低拷贝，转基因安全性较高。

转基因甘蔗的研制及其商品化应用具有独特的优势。首先，甘蔗是无性繁殖作物，在我国蔗区栽培条件下一般不开花，即使在某些特殊气候地区开花，其花粉也是败育的，转基因植株的外源基因不易漂移，生态安全性较好；其次，甘蔗是蔗糖或燃料乙醇的工业原料，加工蔗糖需要经过107 ℃的高温炼煮，外源基因表达的蛋白必然会被分解，而燃料乙醇又非食用品，转基因食品安全系数较高；再次，甘蔗是天然的工业化工原料，转基因原料同样是集中加工的，不容易扩散；最后，转基因甘蔗植株可在短时间内经组培扩繁获得大量种苗，商品化进程快。综上所述，甘蔗不仅是转基因安全等级最高（Ⅳ级）的作物，同时也是转基因改良最容易成功的作物之一。迄今，水稻等为数不多的几种单子叶植物的农杆菌介导转基因方法已经比较成熟，但是，相对双子叶植物而言，单子叶植物农杆菌介导的转化率总体比较低，其中农杆菌介导遗传转化甘蔗的效率不高，已经成为农杆菌介导的甘蔗转基因育种的“瓶颈”问题，因为只有获得一定数量规模的转基因甘蔗群体，才有可能筛选到优良的单株。因此，农杆菌介导的甘蔗转基因实验中，大量的工作都集中在培养基的配制和接种，尤其是培养基的配制。在常规的农杆菌介导甘蔗转基因过程中，需要添加一些能抑制农杆菌生长的抗生素，这些抗生素不耐高温高压，只能通过过滤灭菌后才能加入培养基中。常规情况下是，培养容器和培养基经过高温高压灭菌后，冷却到40 ℃-50 ℃，再加入经过滤灭菌后的抗生素，然后分装到培养容器，冷却凝固后备用。以上工作程序繁锁、工作量大。如果能找到一种无需高温高压、又能抑制农杆菌生长、同时还不影响甘蔗正常生长的培养基，就可以解决以上问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便的农杆菌介导甘蔗转基因方法。

 　本发明的目的是通过以下方法实现的。

　　本发明的一种简便的农杆菌介导甘蔗转基因方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、选择培养、筛选培养、壮苗培养和生根培养，其特征在于：

　　1. 抑菌剂的配制：使用益培隆杀菌剂配制抑菌剂1号和抑菌剂2号；抑菌剂1号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶药剂中加入20 ml蒸馏水稀释后与B瓶药剂混合，并用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂1号；抑菌剂2号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶药剂中加入20 ml蒸馏水稀释后与B瓶药剂混合，加入6 g Timentin，并用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂2号；所述益培隆杀菌剂由A瓶药剂和B瓶药剂组成；Timentin为一种抗生素，固体，由替卡西林钠与克拉维酸钾，按照重量比为15:1的比例组成，其中替卡西林钠纯度不低于99.1%，卡拉维酸钾纯度不低于99.2%，由市场购得；Timentin具有广谱杀菌作用；

2. 培养容器消毒：将培养瓶及瓶盖在抑菌剂1号与水的体积比为0.3 %～0.5 %（Ｖ/Ｖ）的水溶液中浸泡不少于10 h，保存备用；

3. 农杆菌转化：选择携带bar基因的植物表达载体，导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105中、制备转化菌液、侵染甘蔗心叶；