[发明专利]一种重组蛋白质及其单克隆抗体的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体的说，本发明涉及一种新的重组蛋白，编码该重组蛋白的核苷酸序列，以及含有上述核苷酸序列的质粒载体，转化有上述质粒载体的菌株，还涉及使用上述的重组蛋白制备心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，并应用于急性心肌梗死(AMI)早期诊断。 

背景技术

急性心肌梗死是指急性、持续性缺血、缺氧(冠状动脉功能不全)所引起的心肌坏死，是一种严重影响人类健康的心血管疾病。近年来，该疾病的发病率逐年上升，患病人群年轻化趋势愈演愈烈，但治疗效果却不甚理想，其中的一个关键原因是无法实现急性心肌梗死的早期快速诊断以争取治疗时间。从而导致患者病情恶化甚至死亡。因此，能够在心肌梗死的早期做出正确的诊断显得尤为重要。 

研究表明，人心脏型脂肪酸结合蛋白(fabp3)是目前早期诊断AMI最具有特异性和敏感性的生化指标。该蛋白等电点为5.1，分子量为15KD左右，它可将脂肪酸从细胞质膜向发生酯化和氧化的部位运输，从而进入线粒体的能量代谢体系之中，是脂肪酸在此氧化分解并最终生成三磷酸腺苷(ATP)，为心肌收缩提供能量。正常人的血液中不含有心脏型脂肪酸结合蛋白，但在胸痛后0.5-3小时后浓度开始上升，在4-8小时内达到最高值，在12-24小时内恢复到正常水平；而且心脏型脂肪酸结合蛋白专一于心肌的损伤，具有高度 特异性，基于心脏型脂肪酸结合蛋白的以上特点使得其成为理想的AMI早期诊断指标。因此，特异性检测识别人心脏型脂肪酸结合蛋白显得尤为重要。目前，以免疫学为基础的血清学检测，由于其操作简便，结果易于判定，已成为主流方向。该方法主要是通过制备得到的人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体实现对人心脏型脂肪酸结合蛋白的特异性检测。常规的人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体制备所使用的免疫原是基因工程技术表达的完整蛋白，但由于碱基密码子的缘故，该蛋白在大肠杆菌中表达困难，表达量极低，导致后续的纯化工作难以开展，严重阻碍其单克隆抗体的制备。另外，由于抗原表位氨基酸序列同源性的缘故，使用心脏型脂肪酸结合蛋白全长序列作为免疫原制备得到的单克隆抗体特异性差，可能识别其它蛋白，从而导致检测结果失真。 

发明内容

设计目的：避免背景技术中的不足之处，通过设计一种重组蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现心脏型脂肪酸结合蛋白的特异性检测识别，既增强了检测灵敏度，又不会导致检测结果失真。 

设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以心脏型脂肪酸结合蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原两个特异性优势抗原表位，序列比较结果显示所选择的两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为了促进所选择优势抗原表位对BALB/c小鼠免疫系统的刺激，增强免疫效果，故分别将所选择的两个优势抗原表位序列重复后通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接，形成重组蛋白氨基酸序列。(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的表达以提高表达量。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接， 将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-28a(+)，构建重组蛋白表达载体。(5)重组蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，筛选得到重组蛋白表达菌株。(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心后，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化重组蛋白。(7)纯化后的重组蛋白多次免疫BALB/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选并最终得到杂交瘤细胞株。(8)将杂交瘤细胞株分别制备BALB/c小鼠腹水，使用辛酸-硫酸铵法及Protein G分两步纯化单克隆抗体，并分别标记辣根过氧化物酶(HRP)。(9)ELISA正交实验筛选显示7C3单抗包被与5F6-HRP配对检测心肌梗死为最佳组合。 

技术方案1：一种重组蛋白质，该重组蛋白质具有如序列表SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。 

技术方案2：一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含如序列表SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。 

技术方案3：一种核苷酸序列，该核苷酸序列如序列表SEQ ID No：4所示，可编码权利要求1-2所述的重组蛋白质。 

技术方案4：一种质粒载体，该质粒载体含有权利要求3所述的核苷酸序列。 

技术方案5：一种菌株，该菌株包含采用权利要求4所述的质粒载体。