[发明专利]用于促进汉坦病毒融合蛋白G1S0.7有效提呈的重组腺病毒高表达载体pCAG-G1S0.7-HSP70C

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及分子生物学、免疫学及免疫应用等相关领域。本发明涉及腺病毒重组转移载体的改建及其对肾综合征出血热(HFRS)致病原的一种用于促进汉坦病毒融合蛋白G1S0.7有效提呈的重组腺病毒高表达载体pCAG-G1S0.7-HSP70C。

背景技术

肾综合征出血热及其基因工程疫苗研究现状：

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus，HV)引起，由鼠类等传播的一种急性病毒性传染病，临床上以发热、出血和急性肾功能损害为主要特征。中国是世界上HFRS疫情最严重的国家，具有流行范围广、发病人数多、病死率高等特点，到目前为止临床上尚缺乏特异有效的治疗药物。

为易感人群接种疫苗是预防传染性疾病大规模扩散最有效的防控措施。因此，针对HFRS疫苗的研究一直是该领域的热点。国内外近年来虽已研制出HFRS的灭活疫苗，但从部分人群试用的情况来看，该类疫苗还存在明显不足，主要是其诱导机体产生中和抗体的能力较弱，也不能有效地刺激细胞免疫应答。目前在HFRS基因工程疫苗基础研究中主要使用的是病毒囊膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)，但GP免疫原性相对较弱，刺激机体产生的抗体出现较晚，滴度亦不高。本发明人多年对HV中免疫原性最强的核蛋白(Nucleocapsid Protein，NP)的结构及功能，NP与GP不同片段嵌合基因(G1S0.7、G2S0.7)的构建及其表达，以及不同融合基因(蛋白)刺激机体免疫应答的能力及其影响因素等进行了较为深入的研究。一系列体内、外实验结果表明，上述嵌合基因在腺病毒表达系统中能有效地刺激机体的体液免疫(包括中和抗体)应答以及细胞免疫应答，且其效果均高于非嵌合组。

然而在研究中我们也发现了一些问题，如尽管利用各种系统均能表达出完整的融合蛋白，但总的来说蛋白表达量还是偏低。此外，用融合蛋白免疫动物后虽然各表达系统均能刺激机体产生体液及细胞免疫应答，且腺病毒表达系统的效果要优于其他系统，但是整体的免疫水平还不十分理想。因此，进一步选择合适的表达载体、优化表达系统对目前HFRS基因工程疫苗的研究有着重要的意义。

本申请人前期对含嵌合基因G1S0.7的重组腺病毒转移载体G1S0.7-pShuttle进行改建，将其CMV启动子替换为CAG启动子/增强子，得到含CAG启动子/增强子的汉坦病毒融合蛋白G1S0.7的重组腺病毒转移载体，命名为G1S0.7-pCAG，整合入腺病毒载体DNA中，得到重组腺病毒rAd-G1S0.7-pCAG。通过与未替换启动子的重组腺病毒rAd-G1S0.7比较融合蛋白G1S0.7的表达水平，结果显示该重组腺病毒能有效提高G1S0.7的表达。

在此基础上，本发明将HSP70抗原递呈分子基因C末端(HSP70359-610aa)连接到该重组转移载体上，利用基因重组技术将重组片段整合入腺病毒载体DNA中，得到能够促进汉坦病毒融合蛋白G1S0.7有效提呈的重组腺病毒高表达载体。

表达优化腺病毒表达载体，促进机体对抗原的提呈：