[发明专利]一种提高土霉素产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于链霉菌代谢工程技术领域，具体涉及高产土霉素菌株的获得、穿梭质粒的构建和通过发酵条件优化提高所培育的突变菌株的土霉素产量的方法。

背景技术

早期抗生素高产菌株的方法主要通过传统菌株的选育获得，通过比较不同的突变株的芽孢，菌落形态，色素生成及抗生素合成量的比较，来选育高产菌株。在获得了一些高产或低产突变株后，研究者们开始对抗生素的合成途径，以及这些突变株与原始菌的区别在DNA水平、表型、生长、代谢途径的调控等方面进行了深入的研究，利用分子生物学的手段进行基因水平的操作从而获得高产菌株。但是目前所报道的分子生物学操作获得的突变株大部分都是利用野生型菌株或标准菌株作为出发菌株，由于这些菌株的遗传背景较清楚，容易进行基因水平的操作，但是这些菌株本身抗生素的产量低，获得的突变株与工业生产所用的经过传统方法诱变获得的突变株相比产量远远不如工业生产菌种。而利用工业生产菌株进行分子生物学改造往往得不到很好的效果，经过多次突变选育得到的工业生产菌株，具有生长周期短、产量高的优点，但是其遗传背景较为复杂，突变的位点不清楚，在此基础上进行基因的敲入或敲除往往被染色体上其他的调控基因或回补途径所干扰，抗生素的产量得不到显著的提高。这是目前对传统诱变高产菌株进行基因工程改造的一个重大难点。

目前临床应用的抗生素大多有链霉菌生产，作为抗生素的生产菌株，多种链霉菌已经进行全基因组测序，并通过基因序列的同源性比对，对基因的功能进行了预测，大部分抗生素的合成途径中相关酶的编码基因是成簇排列的，且大部分代谢途径专一的调控因子、抗性基因都位于该基因簇的附近，这为基因工程改造提供了便利。

龟裂链霉菌(Streptomyces Rimosus)作为工业用于生产四环素类抗生素的生产菌株，也是土霉素的主要生产菌株。土霉素(Oxytetracycline，OTC)是一种临床上广泛应用的广谱抗生素，由Finlay等人于1950年首次报道在Streptomyces rimosus中发现。目前报道的OTC生产菌还有：Streptomyces capuensis，Streptomyces henetus和Streptomyces platensis等。OTC对革兰氏阳性、阴性细菌，螺旋菌，立克次体以及一些病毒具有抗菌性，通过可逆地结合到30S核糖体亚基上，阻止氨酰tRNA核糖体复合体的形成，从而达到抑菌的效果。

然而，为了提高土霉素的产量，本领域还有必要进一步研究提高土霉素产量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种优化土霉素生产菌使之高产土霉素的方法。

在本发明的第一方面，提供一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法，所述方法包括：在龟裂链霉菌中增加oxyA，oxyB和oxyC基因的表达。

在一个优选例中，在龟裂链霉菌中(如基因组中)增加1-8个拷贝的oxyA，oxyB和oxyC基因。

在另一优选例中，所述方法包括：

(1)提供表达载体，所述表达载体中包含oxyA，oxyB和oxyC基因的序列；

(2)将表达载体转化龟裂链霉菌，选择基因组中整合有(1-8个拷贝；较佳地，1-5拷贝，如3拷贝、2拷贝)外源的oxyA，oxyB和oxyC基因序列的重组龟裂链霉菌。

在另一优选例中，oxyA，oxyB，oxyC基因序列分别存在于不同的表达载体中，或存在于同一表达载体中。

在另一优选例中，所述的oxyA，oxyB和oxyC基因序列以串联的形式存在。

在另一优选例中，所述的oxyA，oxyB或oxyC基因序列之间，存在或不存在连接序列。

在另一优选例中，所述的oxyA，oxyB和oxyC基因序列串联成SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的表达载体中，oxyA，oxyB和oxyC基因序列的5’端，包括红霉素抗性基因启动子(ermE)。

在另一优选例中，所述的表达载体是pSET152载体。

在本发明的另一方面，提供一种重组的龟裂链霉菌，其基因组中整合有外源的oxyA，oxyB和oxyC基因。

在一个优选例中，所述的重组的龟裂链霉菌中(基因组中)，含有1-8个拷贝的外源的oxyA，oxyB和oxyC基因。

在另一优选例中，所述的重组的龟裂链霉菌是通过前面任一所述的方法制备获得。