[发明专利]土壤中H9亚型禽流感病毒分子的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于禽流感病毒分子检测技术领域，涉及一种土壤中H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)分子的检测方法，尤其适用于一种利用反转录巢式PGR(RT-nested PGR)技术快速检测土壤环境中H9亚型禽流感病毒。

背景技术

禽流行性感冒(简称禽流感，Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒引起禽类的一种急性高致死性的烈性传染病，主要引起禽类呼吸系统疾病、产蛋下降乃至急性致死和高死亡率等为特征的烈性传染病，可以感染鸡、火鸡、鸭等家禽及野鸟多种禽类的烈性传染病，被国际兽医局(OIE)列为A类传染病，并列入国际公约动物类传染病名单。1992年2月禽流感被我国农业部《家禽家畜防疫条例》列为甲类监测传染病。

禽流感不仅给养禽业造成严重经济损失，而且通过禽类粪便以及畜禽舍附近形成的微生物气溶胶而散布到空气、饲料、水源等环境当中，造成污染，尤以土壤污染为重。土壤一旦被污染，其组成和理化性质等会发生变化从而破坏其自身的正常功能，并可通过土壤中病原微生物的进一步扩散等过程进而对地下水造成污染甚至对人体健康构成危害。近十几年来，畜禽舍气源性传染病和人畜共患病爆发流行频繁，不仅给畜牧业造成严重损失，而且威胁公民的健康和公共安全。传染病的有效控制离不开传播途径的研究，因此，养殖场污染土壤的治理与修复就显得至关重要。随着集约化养殖的进一步发展扩大，养殖场和屠宰场周围的土壤环境污染问题越来越受到人们的关注，其防制已直接关系到养禽业的持续稳定发展和人们的身体健康。虽然国内外已有许多学者从不同方面对病原微生物的控制等进行了一些研究，且用于病原微生物的化学消毒剂种类较多，但对被污染土壤进行灵敏有效的检测，这方面相关研究还很少，土壤污染仍成为当前面临的一大难题，因此，土壤环境动物源禽流感病毒的污染控制与化学修复技术研究具有非常重要的意义，筛选出针对禽流感病毒污染土壤的化学修复剂也非常必要。随着分子生物学方法的发展，核酸扩增技术得到了广泛的应用。目前，已衍生出多种不同的扩增技术。巢式PCR技术相比PCR技术具有以下优点：灵敏度高、特异性强，可以在106基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，也不像二次PCR容易产生成片的产物，是效果最好的PCR。

从目前的文献和专利查询结果知道，反转录巢式PCR方法检测禽流感病毒仅在鼻腔粘液等病料中有相关报道，但对于在土壤中还未见报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种土壤中H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)分子的检测方法。其优点在于灵敏度高、特异性强、准确性高、检测时间短、填补土壤中检测禽流感方面的空白领域等。

为了实现上的目的，本发明采用以下技术措施：

一种基于反转录巢式PCR(RT-nested PCR)的快速检测土壤环境中H9亚型

禽流感病毒污染的方法，其步骤是：

(1)引物设计：以NCBI公布的H9亚型禽流感(登录号为JN381629)HA基因序列为参照，通过premier premier V5.0引物设计软件(premier biosoft international公司)不断调整引物的碱基数直至符合巢式PCR引物的要求。最终确定在542bp-1109bp的碱基序列之间设计内外两对引物，外引物对扩增长度为：567bp，内引物对扩增长度为：173bp。

外引物-F：5’-CTATCCAAGACGCCCAATACAC-3’；

外引物-R：5’-CAACCAGCGACTAGCCTTGA-3’；

内引物-F：5’-AAATACCACATTGCCATTCCAC-3’；

内引物-R：5’-AGCCTTGACCAACCTCCCTC-3’。

(2)待检土壤样品的处理：将同一地点不同位置所采的土壤混合，过20目分析筛，去除土壤中的石头及杂草。

(3)待检土壤样品中RNA的提取：

使用土壤RNA提取试剂盒(Omega公司备注：RNA Column中的代表注册商标)，提取土壤中的总RNA。其步骤如下：

1.称取1g Glass Beads I和1gGlass Beads II在15mL离心管中，添加2.5g土壤样品。

2.加入2mL Buffer SRX至管中，涡旋1min混匀样品。

3.加入200μL Buffer DS至管中，涡旋30s混合样品。

4.添加1mL水饱和酚和1mL氯仿，最大速度涡旋10min。4℃，4,000×g离心10min。

5.取上层水相到新的15mL离心管