[发明专利]用于检测弓形虫缓殖子的引物和探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于检测弓形虫缓殖子的引物和探针及试剂盒。

背景技术

弓形虫，也称为弓浆虫，中医叫三尸虫，属于顶端复合物亚门，孢子虫纲，真球虫目，等孢子球虫科、弓形体属，是细胞内寄生虫，随血液流动到达全身各个部位，破坏大脑、心脏、眼底，致使人的免疫力下降，从而患各种疾病。弓形虫是一种可通过水源和食源传播的寄生虫病，对人和动物健康具有极大潜在危险，它们寄生于宿主细胞内，可以感染包括人在内的所有恒温脊椎动物。弓形虫感染人在某些情况下，后果非常严重甚至有生命危险，例如妊娠期间的胎儿和免疫缺陷的人群。动物感染弓形虫会造成母畜流产、木乃伊胎、死胎，猪场爆发本病，死亡率更是高达60％以上。但是，目前检测弓形虫的方法，普遍存在敏感性低、特异性差的缺点。

弓形虫缓殖子，是包囊内的滋养体，直径约5-10μm，在包囊内不断增殖，达到数个至数百个，在一定条件下包囊可破裂，缓殖子重新进入新的细胞形成新的包囊，可长期在组织内生存。

BAG1，弓形虫缓殖子期抗原1，是弓形虫缓殖子主要期特异性抗原之一，在速殖子期检测不到该基因。BAG1在诱导弓形虫速殖子向缓殖子转变的早期被表现，是成熟组织包囊的主要蛋白。BAG1常作为弓形虫速殖子向缓殖子转化的指示蛋白而被研究，是一种胞浆抗原。

Real-time PCR，实时定量PCR，是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。

发明内容

本发明要解决目前弓形虫的检测方法普遍存在敏感性低、特异性差的技术问题，提供一种用于检测弓形虫缓殖子的引物和探针，利用该引物和探针进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测，可准确快速地检测到弓形虫缓殖子的感染，其敏感性高、特异性强。

此外，还需要提供一种包含上述引物和探针的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种用于检测弓形虫缓殖子的引物，包括正向引物和反向引物，该正向引物和反向引物是扩增弓形虫缓殖子期特异性抗原BAG1基因保守区域的一对引物。

优选的，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的另一方面，还提供了一种用于检测弓形虫缓殖子的探针，该探针与权利要求1或2所述引物扩增的弓形虫BAG1基因保守区域杂交。

优选的，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的另一方面，还提供了一种用于检测弓形虫缓殖子的试剂盒，包含上述引物。

所述试剂盒还包含上述探针。

所述试剂盒还包含标准品，该标准品为含有弓形虫缓殖子期特异性抗原BAG1基因的重组质粒。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测弓形虫缓殖子的方法，包括以下步骤：

提取待测样本RNA，并以其为模板，用权利要求5所述的试剂盒进行实时荧光定量PCR检测。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述引物在制备检测弓形虫缓殖子的产品中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述探针在制备检测弓形虫缓殖子的产品中的应用。

本发明用于检测弓形虫缓殖子的引物和探针及试剂盒，通过实时荧光定量PCR方法检测弓形虫缓殖子，可准确快速地检测到弓形虫缓殖子的感染，敏感性高、特异性强，适用于临床检测，或用于弓形虫缓殖子的形成和激活机制研究。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的弓形虫缓殖子RNA的RT-PCR结果图；

图2是本发明实施例1的Real-time PCR标准曲线图；

图3是本发明实施例2敏感性比较试验中Real-time PCR结果图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。