[发明专利]苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因、其表达产物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗铬菌基因，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因、其表达产物及其应用。 

背景技术

铬虽然是人体必须的微量元素，但是过量的铬尤其是六价铬具有很强的毒性，对人体具有强烈的致病性。我国每年的铬盐产量已经超过16万吨，而铬渣的排放量却在35～42万吨，其含有的六价铬约有3500吨。六价铬生物毒性极大，是造成环境污染的主要重金属之一。因此，铬污染的治理引起了人们广泛的关注。传统的物理和化学治理法包括调节pH、絮凝沉淀、离子交换和活性炭吸附等，但这些方法需要消耗其他能源或使用大量的化学试剂，处理成本较昂贵，且存在着二次污染的可能。因此，铬污染的生物治理被看作是一个可以替代的治理策略，具有很大的潜力，比如Evns，吴乾菁，Dermou等人都曾用微生物模拟处理铬污染水，取得一定的效果。如今国内外筛选出的具有还原六价铬的微生物很多，国外学者也已有研究报道称在大肠杆菌、假单胞菌中均发现了含有还原六价铬的基因，分别为YieF基因、NfsA基因。另外在哈维氏弧菌中同样发现了还原六价铬的基因，这些基因表达的蛋白酶均具能在一定条件下将六价铬进行还原，但是国内学者对六价铬还原基因鲜有报道。 

现有的这些微生物或六价铬抗性较小，或六价铬还原能力较低，或所需还原时间较长，普遍离工业应用还有一定距离。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种六价铬还原基因及其重组表达载体、表达盒或重组菌，并成功将其成功转化，获得了具有对六价铬具有很强的还原性的高活性的蛋白酶。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是： 

一种苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一种由上述苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因表达出的蛋白酶。 

上述蛋白酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。 

所述蛋白酶可在还原六价铬中应用。 

含有上述苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。 

扩增上述苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因的全长或其任意片段的引物对。 

本发明具有积极有益的效果： 

本发明从具有还原Cr⁶⁺作用的苏云金芽孢杆菌YB-03菌株CGMCC NO.5653中克隆出了六价铬还原基因，并成功转化、诱导表达出具有很高活性的蛋白酶，该蛋白酶对六价铬具有很强的还原性，在铬污染的处理中具有重要的应用价值。

本发明所涉及的苏云金芽孢杆菌YB-03菌株（Bacillus thuringiensis），已于2011年12月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，该苏云金芽孢杆菌YB-03菌株（Bacillus thuringiensis）的保藏编号为CGMCC NO.5653。 

附图说明

图1为本发明六价铬还原基因PCR结果电泳图谱； 

图2为本发明PMD19-T+目的基因双酶切结果电泳图谱；

图3为ET-28载体+目的基因双酶切验证结果电泳图谱；

图4为SDS-PAGE蛋白质电泳图；

图5为SDS-PAGE蛋白质电泳图；

图6为在2mmol/L NADH下，本发明蛋白酶还原六价铬结果；

图7为无NADH下，本发明蛋白酶还原六价铬结果；

图8为目的蛋白还原六价铬结果图。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中六价铬的测定方法采用二苯碳酰二肼分光光度法；总铬的测定方法采用高锰酸钾—二苯碳酰二肼分光光度法，其它未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。 

实施例1  六价铬还原细菌的分离、筛选 

取活性污泥（采集时间：2010年9月；采集地点：郑州市五龙口污水处理厂；采集人：魏斐）10g于90ml的无菌水中，分别稀释为10^-1～10^-6六个梯度。从每个梯度中取溶液1ml，涂布于含有适量浓度Cr⁶⁺的LB固体培养基中，放入37℃培养24h。