[发明专利]一种重组禽黄病毒E蛋白及其应用

权利要求书

1.一种编码禽黄病毒E蛋白的重组基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种重组禽黄病毒E蛋白，其特征在于，该蛋白由权利要求1所述的重组基因序列编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组禽黄病毒E蛋白的表达载体，其特征在于，该表达载体是将SEQ ID NO:1所示的重组基因序列插入到质粒pET-32a中得到的重组质粒pET-32a-E。

4.一种表达重组禽黄病毒E蛋白的工程菌株，其特征在于，该菌株含有权利要求3所述的表达载体pET-32a-E，宿主菌为大肠杆菌。

5.用权利要求2所述重组禽黄病毒E蛋白制备的检测禽黄病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒。

6.按照权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的操作方法包括如下步骤：

包被：用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液稀释包被抗原包被96孔ELISA板，检测孔重组禽黄病毒E蛋白包被量为4.375μg/孔，在4℃条件下过夜包被，甩干后用PBST洗涤2次；

封闭：封闭液为含1%BSA 的PBST，300μL/孔，37℃条件下封闭2小时后甩干，用PBST洗涤3次；

血清作用条件：血清样品稀释液为PBST，将待检血清样品及阳性和阴性对照血清做400倍稀释，每孔加入100μL，37℃条件下孵育1小时后甩干，用PBST洗涤3次；

酶标二抗作用条件：

检测鸭血清内抗体：将辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭抗体用PBST做400倍稀释，100μL/孔，37℃条件下孵育1小时后甩干，用PBST洗涤3次；

检测鸡血清内抗体：将辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡抗体用PBST做5000倍稀释，100μL/孔，37℃条件下孵育1小时后甩干，用PBST洗涤3次；

底物显色：TMB底物100μL/孔，37℃条件下作用10 min，再加入2 M硫酸100μL/孔，终止反应；

读数：采用酶标仪吸光度450nm下读取数据；

参考血清的确定：参考阳性血清为经禽黄病毒免疫获得的鸡/鸭阳性血清OD_450nm值≥0.75；参考阴性血清为经筛选获得的SPF鸡/鸭阴性血清OD_450nm值＜0.2；

结果判定标准：当参考阳性血清OD值≥0.75，参考阴性血清OD值＜0.25，同时参考阴性血清OD值/参考阳性血清OD值＜0.2，表明阴阳性对照成立；以待检样本OD值与参考阴性血清OD值的比值S/N≥2.1判为阳性。

7.权利要求2所述的重组禽黄病毒E蛋白在制备单抗、多抗、疫苗或蛋白芯片中的应用。